Información completa y detallada sobre la tecnología de biología molecular (una tecnología para estudiar animales y plantas)
Con el desarrollo continuo de las ciencias biológicas y la química, la comprensión de las personas sobre los organismos vivos se ha profundizado gradualmente hasta el nivel microscópico. Desde organismos individuales hasta órganos, tejidos y células, y luego desde estructuras celulares hasta el nivel molecular de ácidos nucleicos y proteínas, las personas se dieron cuenta de que podían comparar horizontalmente diferentes especies y diferentes especies dentro de la misma especie detectando estructuras lineales a nivel molecular ( como secuencias de ácidos nucleicos individuales, la diferencia entre diferentes células o diferentes estados fisiológicos (patológicos) de un mismo individuo. Esto proporciona una poderosa plataforma tecnológica para diversos campos de la biología y la medicina. Introducción básica Nombre chino: Tipos de tecnología de biología molecular: cuatro tipos de aplicaciones: investigación de enfermedades genéticas Objetos de investigación: clasificación, aplicación, clasificación de animales y plantas Actualmente, las técnicas de biología molecular más utilizadas son las siguientes: PCR polimorfismo de conformación monocatenaria Análisis PCR -El análisis del polimorfismo de conformación de una sola cadena (PCR-conformación de cadena única ***isis, PCR-SSCP) es uno de los métodos más utilizados en la detección de mutaciones genéticas en los últimos años. La tecnología PCR-SSCP se basa en mutaciones para provocar cambios conformacionales de tercer nivel en el ADN monocatenario, y las mutaciones se pueden determinar observando el cambio de movilidad del ADN monocatenario en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. Después de amplificar la muestra mediante PCR, el producto puede producir dos hebras individuales después de la desnaturalización. Si hay una mutación genética, incluso si se trata de una anomalía de una base, la conformación de la hebra única cambiará y el ADN normal y mutado. Se agregarán hebras individuales en la electroforesis en gel de acrilamida (PAGE), se pueden mostrar diferentes patrones de bandas para determinar el tipo salvaje y el tipo mutante. Las principales ventajas del análisis PCR-SSCP son la simplicidad y la alta sensibilidad. Pero la técnica no puede determinar la ubicación y la naturaleza de la mutación. La sensibilidad de la detección de mutaciones por PCR-SSCP disminuye a medida que aumenta la longitud del producto de la PCR y generalmente se usa para detectar mutaciones en exones más pequeños. A veces, el cambio conformacional causado por un solo cambio de nucleótido es tan pequeño que es posible que no se detecte mediante electroforesis PAGE. Cuando el producto de PCR o el ADN a analizar tiene menos de 200 pb, el análisis PCR-SSCP puede detectar entre el 70% y el 95% de. mutaciones. Si se utiliza electroforesis capilar en lugar de PAGE, la eficiencia de la detección de mutaciones se puede mejorar considerablemente. En 1997, Wallace propuso combinar PCR-SSCP con análisis de ADN bicatenario heterólogo (heteroduplex DNA ysis, HA), que se denominó SSCP/HA. Parte de los productos de PCR se desnaturalizaron y se sometieron a análisis SSCP para comprender si había mutaciones. Los productos de PCR restantes se utilizan directamente en electroforesis para detectar mutaciones que contienen ADN bicatenario heterólogo. El gel de electroforesis está teñido de plata. La banda formada por el ADN monocatenario es de color naranja o marrón, mientras que el ADN bicatenario aparece gris. -negro. Este método integral puede detectar mutaciones en dos niveles diferentes: polimorfismo de configuración monocatenaria y análisis de configuración heterodúplex. Es un método de detección de mutaciones rápido y económico, pero no puede proporcionar información sobre la ubicación de la mutación. PCR-SSCP tiene muchas tecnologías mejoradas, como el método de polimorfismo de conformación de una sola hebra de ARN (PCR-rSSCP), análisis de polimorfismo conformacional de fragmentos de una sola hebra de secuenciación didesoxi (PCR-ddF), tecnología de huellas dactilares de enzimas de restricción (PCR-REF), etc. El método PCR-rSSCP se basa en el principio de que la conformación del ARN es más sensible a la sustitución de una sola base. Se agrega un cierto tipo de promotor al cebador de la PCR y las mutaciones se identifican mediante la diferencia en la migración electroforética de la conformación del ARN transcrito. El producto de la PCR se transcribe utilizando el método PCR-ddF y el transcrito se somete a una reacción de secuenciación de terminación didesoxi de Sanger utilizando transcriptasa inversa. Se observa la deriva monocatenaria producida por el tratamiento de fusión sobre el gel no desnaturalizante y la adquisición y deleción. del fragmento de terminación después de la mutación para determinar las mutaciones. El método PCR-REF combina las ventajas de las tecnologías RFLP y SSCP. Los fragmentos amplificados por PCR que se van a analizar se digieren secuencialmente con 5 a 6 enzimas de restricción, se mezclan y se marcan en los extremos, finalmente se desnaturalizan y se separan mediante electroforesis en un método no. De este modo se obtiene información de doble mutación a partir de la longitud del fragmento y la conformación del fragmento.
Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) utiliza la diferencia en la solubilidad o desnaturalización de los fragmentos de ADN determinada por la secuencia de bases para lograr el propósito de separar fragmentos de ADN de tipo salvaje y mutante. Este método analiza hasta una base. Cuando las dobles hebras de ADN migran a lo largo de un gel de poliacrilamida con un gradiente de concentración de desnaturalizante creciente, la parte de la molécula de ADN con una temperatura de fusión (Tm) baja se desnaturaliza y se funde gradualmente. Generalmente, el heterodúplex en la parte de bases no coincidentes tiene la Tm más baja y es más fácil de fundir, seguido de la parte rica en pares de bases AT. La parte rica en pares de bases GC tiene un valor de Tm más alto, por lo que es más difícil de fundir. Por lo tanto, cuando se someten a electroforesis bicatenarias y heterodúplex de ADN normal en un gel desnaturalizante en gradiente, los heterodúplex siempre se funden primero. El ADN bicatenario generado por PCR se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante con concentraciones crecientes de urea y formamida. Cuando un determinado fragmento de ADN migra a una posición donde la concentración de desnaturalizante es equivalente a su Tm más baja, el fragmento de ADN bicatenario se funde. a baja temperatura la cadena se abre y se funde parcialmente, lo que hace que la velocidad de migración del ADN disminuya significativamente. Al observar el cambio en la movilidad de la muestra, se puede determinar si hay una mutación. DGGE es muy sensible e incluso si el heterodúplex contiene solo una base no coincidente, sus cambios de movilidad se pueden distinguir durante la electroforesis. La tasa de detección de mutaciones de base única del método DGGE puede alcanzar el 95% cuando la longitud del fragmento de ADN está dentro de los 600 pb. El éxito de la DGGE depende del cambio en la movilidad después de que se desnaturalice la parte del ADN bicatenario que se funde a baja temperatura. Sin embargo, a la concentración desnaturalizante equivalente a la Tm más alta, todos los fragmentos de ADN correspondientes pueden fundirse, lo que hace que la prueba no pueda detectar sustituciones de bases presentes en fragmentos de ADN de Tm alta. Para resolver este problema, se puede diseñar una cola rica en GC en el extremo 5' de un cebador de PCR, de modo que un extremo del producto de amplificación de PCR sea rico en pares de bases de GC, asegurando que la gran mayoría de los fragmentos de ADN no se funde completamente, los heterodúplex parcialmente fundidos aún se pueden distinguir en la región de mayor concentración de desnaturalizante. Esta mejora hace que la tasa de detección de mutaciones de DGGE sea cercana al 100%, pero DGGE solo puede detectar la presencia de mutaciones pero no puede determinar la ubicación de las mutaciones. El método DGGE requiere el diseño de cebadores de PCR óptimos para fragmentos específicos y condiciones de desnaturalización óptimas. Este proceso es relativamente complejo. La preparación de gel desnaturalizante en gradiente requiere equipos costosos, por lo que no es fácil de implementar en laboratorios convencionales. Método de análisis del polimorfismo de conformación de doble cadena El análisis de polimorfismo de conformación de doble cadena (DSCA) utiliza cebadores marcados con fluorescencia para amplificar fragmentos de investigación relevantes mediante PCR como una molécula de ADN (FLR) de referencia marcada con fluorescencia. Luego, la molécula FLR de referencia marcada se hibrida con el fragmento amplificado por PCR que se va a analizar. Debido a que las secuencias de nucleótidos de la muestra y FLR son similares, se formará una estructura bicatenaria entre las cadenas directa y antisentido de todo el ADN en la solución de reacción de hibridación. Sólo el ADN bicatenario que coincide con la cadena positiva de la molécula FLR marcada fluorescentemente puede ser detectado por el sistema de detección láser del secuenciador de ADN después de la electroforesis. Por lo tanto, ambas cadenas dobles detectables tienen la misma cadena positiva para FLR y la movilidad electroforética de las cadenas dobles hibridadas puede ser la misma. Sin embargo, debido a diferencias en las cadenas simples antisentido y diferencias en el grado de desnaturalización de las cadenas dobles, las Las movilidades electroforéticas son, en última instancia, diferentes. A diferencia de la tecnología SSCP, DSCA puede manipular arbitrariamente la formación de dobles hebras desnaturalizadas y el uso de diferentes FLR puede lograr el mejor efecto de separación para muestras difíciles de separar. Además, ajustando la proporción de FLR a las moléculas de ADN de muestra que se van a analizar, la señal heterodúplex hibridada se puede mejorar específicamente y la señal homocigota bicatenaria se puede debilitar. La ventaja de la tecnología DSCA es que determina la presencia de mutaciones en función de la diferencia de tiempo entre la muestra que pasa por el detector fijo, en lugar de la diferencia de distancia de migración en el mismo tiempo de electroforesis. Esto evita la reducción de las tasas de migración debido a diferencias en. Tasas de migración en análisis técnicos como SSCP. Tasa de detección de bandas de movimiento lento. Por otro lado, la longitud efectiva del fragmento de detección de DSCA es de hasta 1 kb. Debido a la intervención del sistema láser, la sensibilidad y la carga de muestra de DSCA se pueden mejorar y reducir respectivamente, y una diferencia de natación de menos de 1 segundo es suficiente para detectar. Esta tecnología se ha utilizado con éxito para detectar 4 mutaciones en el gen de la fibrosis quística y 131 genes alotrópicos en el gen tipo HLA.
La cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC) es uno de los métodos que utiliza cambios en la configuración del ADN para detectar mutaciones genéticas y polimorfismos genéticos. Puede detectar polimorfismos morfológicos y hereditarios de un solo nucleótido. El proceso principal del experimento incluye la amplificación por PCR de muestras de ADN normales y de prueba, la desnaturalización de los productos amplificados y luego la renaturalización. Si existen mutaciones, se pueden formar heterodúplex durante este proceso de renaturalización. En condiciones parcialmente desnaturalizantes, el análisis por cromatografía líquida de alta presión puede distinguir eficazmente las dobles hebras de ADN heterólogo formadas por bases mutantes y bases normales de las dobles hebras de ADN normal. Dado que la resolución de DHPLC puede alcanzar 1 pb/kb y el proceso de operación se puede estilizar completamente, a gran escala y automatizar, el tiempo experimental se acorta considerablemente y se mejora la precisión experimental. Puede usarse como un medio poderoso para la selección preliminar. de cualquier mutación genética en grupos grandes. SSCP tiene más ventajas y tiene amplias perspectivas de aplicación. Muchos trabajos han confirmado la sensibilidad, eficacia y precisión de DHPLC. Amplificación específica de alelo La amplificación específica de alelo (ASA) es un método de detección de mutaciones de un solo nucleótido basado en tecnología de PCR que analiza sustituciones de bases conocidas o eliminaciones de fragmentos pequeños y técnicas convencionales de mutagénesis por inserción. En el diseño de cebadores de PCR, se diseña una base no coincidente en el extremo 3' o en el medio del cebador en función de las propiedades del sitio de mutación conocido, de modo que solo pueda ser complementario al gen mutante o de tipo salvaje y solo amplificar. el gen mutante o de tipo salvaje. La tecnología ASA requiere solo un paso de reacción de PCR y ni siquiera requiere electroforesis ni tecnología de etiquetado. Debido a su rapidez, gran reproducibilidad, bajo costo, ausencia de contaminación isotópica y alta eficiencia, se convertirá en un método prometedor para la detección de mutaciones a gran escala en la población. Al aplicar este método, es mejor evitar que las bases G: T no coincidan, ya que esta falta de coincidencia puede desencadenar una reacción de amplificación. Método de escisión química de bases no coincidentes El método de escisión química de bases no coincidentes (método de escisión química de bases no coincidentes, CCM) logra el propósito de detectar mutaciones puntuales modificando y escindiendo químicamente bases no coincidentes en las dobles hebras del ADN heterólogo. El principio es que los fragmentos de ADN marcados en los extremos se exponen a reactivos químicos que pueden reconocer y modificar bases no coincidentes en heterodúplex (por ejemplo, la citosina no coincidente puede modificarse con hidroxilamina y la timina no coincidente puede modificarse con tetróxido de osmio), el sitio modificado Luego puede ser escindido por productos químicos como el azaciclohexano. Una vez modificado y escindido el ADN, se puede observar la longitud del fragmento de ADN mediante electroforesis para determinar si existe una mutación. Esta tecnología tiene más ventajas que otros sistemas de detección de mutaciones: puede escanear grandes fragmentos de ADN de 1 a 2 kb y localizar sitios de mutación en análisis de secuencia posteriores, con una eficiencia de hasta el 100%. Este método generalmente realiza primero la amplificación por PCR del ADN objetivo y del ADN de tipo salvaje, y luego marca en el extremo el fragmento amplificado del ADN de tipo salvaje. El fragmento marcado se utiliza como sonda para renaturalizar con la secuencia objetivo para formar un heterodúplex. Tetróxido de osmio (OsO4) o modificado con hidroxilamina y escindido con piperidina, y se separaron fragmentos de diferentes longitudes mediante electroforesis en poliacrilamida. En los últimos años, se han utilizado carbodiimidas como modificadores de desajustes, lo que mejora aún más la sensibilidad de este método. El método CCM utilizó inicialmente fragmentos de ADN de isótopos. Después de reemplazar el isótopo con una etiqueta fluorescente, se denominó método de base no coincidente de escisión química por fluorescencia. Este método sigue siendo relativamente sensible y seguro, y puede detectar entre el 95% y el 100% de los isótopos. desajustes. La desventaja del método de base no coincidente de escisión química es que requiere una gran carga de trabajo y requiere el uso de productos químicos nocivos como reactivos de prueba. Aplicación de la tecnología de biología molecular: Puede aplicarse a la investigación de enfermedades genéticas y la detección de patógenos, así como a la investigación sobre la etiología, patogénesis, diagnóstico y tratamiento de tumores a nivel genético molecular. Definición de biología: La biología es la ciencia que estudia los fenómenos de la vida y las leyes de las actividades biológicas. Según los objetos de investigación, se divide en zoología, botánica, microbiología, paleontología, etc. según el contenido de la investigación, se divide en taxonomía, anatomía, fisiología, citología, biología molecular, genética, biología evolutiva, ecología, etc. .; Desde la metodología, se divide en sistemas como biología experimental y biología de sistemas.