¿A qué se debe prestar atención al medir el punto isoeléctrico de una proteína mediante IEF?
Se debe tener en cuenta lo siguiente al utilizar IEF para medir el punto isoeléctrico de proteínas:
La dirección de la electroforesis bidimensional de proteínas es el enfoque isoeléctrico (Isoelectrofocusing, IEF), que es La separación se realiza según el punto isoeléctrico de la proteína, la segunda dimensión es la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), que separa según el peso molecular de las subunidades. Después de dos separaciones de carga y peso molecular, se puede obtener la información del punto isoeléctrico y el peso molecular de la molécula de proteína. Nota:
1. Es necesario que haya un equilibrio entre el enfoque unidimensional y la electroforesis bidimensional. El tiempo depende de la naturaleza de la proteína, generalmente 10 minutos y no más de 15 minutos. .
2. Una carga excesiva de la muestra provocará una deformación del patrón bidireccional, especialmente cuando se enfoca en una dirección. Cuando la concentración de la muestra supera los 5 mg, la proteína se aglomerará y precipitará, provocando rayas horizontales y verticales en dos direcciones.
3. Los reactivos que contienen urea deben evitar un tratamiento con temperatura excesiva, que generalmente no excede los 30 °C, de lo contrario, el isotiocianato producido por la descomposición de la urea provocará la formilación del carboxilo y provocará heterogeneidad de carga.
4. El exceso de detergente afectará gravemente el patrón de electroforesis bidimensional. Por lo tanto, antes de enfocar y equilibrar, enjuague la tira con agua bidestilada para eliminar el detergente residual.
5. En la electroforesis bidimensional, es muy importante que la interfaz entre los geles bidimensionales esté en estrecho contacto. Si el contacto no es bueno o quedan burbujas entre ambos, lo hará. conducen a la difusión molecular durante la transferencia.
Ventajas del enfoque isoeléctrico:
El enfoque isoeléctrico consiste en colocar electrolitos anfóteros portadores en el tanque de electroforesis. Cuando pasa corriente continua, los electrolitos anfóteros forman una red desde el ánodo hasta el cátodo. Un gradiente de pH que aumenta gradualmente. Cuando las proteínas se colocan en este sistema, diferentes proteínas se mueven o se concentran en posiciones de pH correspondientes a sus puntos isoeléctricos.
Ventajas del electroenfoque: Tiene alta resolución y puede separar proteínas cuyos puntos isoeléctricos difieren en 0,01-0,02 unidades de pH; la electroforesis general se ve afectada por la difusión y los cambios con el tiempo y la distancia a medida que se alarga la distancia. Las zonas se vuelven cada vez más anchas, mientras que el enfoque eléctrico puede compensar el efecto de difusión y hacer que las zonas sean cada vez más estrechas.
Debido a este efecto de electroenfoque, no importa dónde se agregue la muestra, se puede enfocar a su punto eléctrico, y también se pueden separar muestras muy diluidas el punto isoeléctrico de la proteína; , y su precisión El grado puede alcanzar la unidad de 0,01 pH.