¿Qué es el VHB?
(1) Patógeno de la hepatitis B-Virus de la hepatitis B VHB
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN, como cierto veneno secretado por una serpiente venenosa que solo se dirige a un organismo específico El virus de la hepatitis B sólo se interesa por el hígado. Biológicamente es un miembro de la familia hepadnavividae. Los miembros de virus de esta familia también se encuentran en mamíferos y aves. Sus estructuras, secuencias genéticas y estrategias de replicación son muy similares, pero no se cruzan entre sí. Además de ser específicos de órganos específicos, también tienen "requisitos raciales" para sus huéspedes. Por ejemplo, el VHB sólo es susceptible a los humanos y los orangutanes.
Una partícula completa del virus de la hepatitis B, también llamada partícula Dane, tiene sólo 42 nanómetros de diámetro, aproximadamente una millonésima parte del tamaño de un huevo común. El virus de la hepatitis B tiene dos partes: cáscara y núcleo. Es decir, además de la hermosa "cápside" que tienen la mayoría de los virus, el virus de la hepatitis B también necesita una "capa" sofisticada. La cubierta es la llamada "capa", que tiene entre 7 y 8 nanómetros de espesor y consta de una bicapa lipídica y una cápsula proteica. La bicapa lipídica contiene antígeno S, antígenos pre-S1 y pre-S2, que juntos constituyen tres formas de proteínas en la capa exterior: grande, mediana y pequeña, llamadas colectivamente antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg), que se conoce comúnmente como anticuerpo australiano. . También hay una historia sobre el origen del antígeno australiano. Se aisló por primera vez del suero de los aborígenes australianos. En ese momento, se pensaba que era un marcador genético exclusivo de la población local, por lo que se le llamó "antígeno australiano". . Sólo más tarde descubrí que se trataba del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. El llamado antígeno es en realidad un elemento que provoca la respuesta de resistencia del cuerpo. Por el contrario, el elemento del cuerpo que puede reconocer y resistir el antígeno es un anticuerpo.
Retire la capa exterior de las partículas de Dano para exponer las partículas centrales del virus de la hepatitis B. La partícula central tiene un diámetro de 28 nanómetros y una simetría icosaédrica. Su superficie es la verdadera cápside del virus, que está compuesta por el antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg). Las nucleocápsides libres sólo se pueden observar en los núcleos de los hepatocitos. Mediante un fuerte tratamiento con detergentes o enzimas, otro antígeno importante del VHB, el antígeno e, también puede quedar expuesto. Su naturaleza no está muy clara, pero la mayoría de la gente piensa que es un fragmento central.
El centro de la partícula de Dano es la doble hebra circular y separada del ADN, y la ADN polimerasa unida a ella. Una de las características más llamativas del genoma del virus de la hepatitis B es que es muy pequeño. Su molécula de ADN contiene aproximadamente 3.200 nucleótidos, lo que es cientos de veces más pequeño que el genoma viral más grande conocido. En comparación con el genoma humano. uno entre un millón. Además, las dos hebras del ADN del virus de la hepatitis B tienen longitudes diferentes, y la hebra larga está completa y de longitud constante, que es la hebra negativa. La cadena corta es una cadena positiva con longitud variable, aproximadamente del 50% al 80% de la cadena larga. Tanto el antígeno de superficie como el antígeno central están codificados por el ADN de las partículas Dane.
En realidad, al microscopio electrónico se pueden observar tres formas diferentes del virus de la hepatitis B: partículas esféricas grandes, partículas esféricas pequeñas y partículas tubulares. Las partículas esféricas grandes son partículas de Dano. Las partículas pequeñas esféricas, de unos 22 nanómetros de diámetro, son el tipo más común en la sangre después de la infección por el virus de la hepatitis B. Se compone de antígenos de superficie y no contiene ADN del virus de la hepatitis B ni ADN polimerasa. Las partículas tubulares también tienen unos 22 nanómetros de diámetro y entre 50 y 70 nanómetros de longitud. En realidad, está formado por varias partículas esféricas pequeñas agregadas, pero también tiene la antigenicidad del HBsAg. Ni los gránulos ni las partículas tubulares son partículas completas del virus de la hepatitis B. Son cápsulas en exceso sintetizadas por el virus de la hepatitis B cuando infecta las células del hígado y están libres en la circulación sanguínea del cuerpo humano.
(2) Preparación de la vacuna contra la hepatitis B
Primera parte: Introducciones del virus de la hepatitis B
El virus de la hepatitis B (VHB) causa inflamación del hígado. El virus se reconoce magnificadamente por las “partículas danesas” redondas e infecciosas acompañadas de envolturas virales vacías en forma de tubo. Las manifestaciones de esta afección incluyen ictericia y una enfermedad similar a la gripe, mientras que la infección crónica puede provocar patologías graves como cirrosis y cáncer. del hígado.
Segunda parte: tratamientos y medidas preventivas para la hepatitis B
El virus de la hepatitis B también puede transcribir ARN a ADN, pero este virus empaqueta la versión de ADN de su genoma en un virus. A diferencia de los retrovirus, el virus de la hepatitis B no se integra en el ADN de la célula huésped.
Aunque los investigadores están investigando nuevos tratamientos prometedores para la hepatitis B, el único disponible actualmente es el interferón, un fármaco que es eficaz sólo en. Del 35 al 40 por ciento de los pacientes son tratados.
Actualmente no existe ningún método antiviral eficaz para tratar la infección crónica por el virus de la hepatitis B, pero tanto las vacunas derivadas de la sangre como las vacunas recombinantes pueden prevenir eficazmente la infección viral, por lo que el desarrollo de La producción de vacunas se ha convertido en un arma importante en la lucha contra este virus.
La vacuna contra la hepatitis B de origen sanguíneo se prepara a partir de plasma que contiene el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). En 1976, Maupas et al. descubrieron por primera vez que las partículas de antígeno de superficie aisladas del suero de portadores del VHB pueden estimular al cuerpo para que produzca anticuerpos anti-HBsAg (HBsAb), que pueden neutralizar el virus de la hepatitis B y prevenir eficazmente la infección por VHB. El contenido de partículas de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en el suero de los portadores puede ser muy alto, por lo que puede usarse para preparar vacunas. Esta es una vacuna derivada de la sangre y la vacuna contra la hepatitis B de primera generación. El antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) es la proteína de la membrana externa del VHB. Está codificado por la región S del genoma del VHB. La región S se divide en tres segmentos: gen preSl, preS2 y S. misma fase y están dispuestos en serie continua y se puede utilizar 1 código de terminación. Estos tres genes codifican la proteína preS1, preS2 y S respectivamente. La región S incluye muchos epítopos de células B y T y desempeña un papel importante en la respuesta inmune del cuerpo contra el VHB. Al mismo tiempo, la proteína S desempeña un papel en la infección por VHB. y las partículas del virus VHB desempeñan un papel importante en el proceso de ensamblaje. Toda la información para la formación y secreción de partículas de HBsAg se encuentra en la proteína S. Hay una señal de retención en el extremo N de la región preSl, que puede antagonizar el efecto de la señal de secreción de la proteína S. 1.2 Inmunogenicidad del VHB.
Los estudios han confirmado que la vacunación con proteína S, también conocida como proteína Bolsa, puede prevenir y tratar eficazmente la hepatitis B.
Kehenning et al. construyeron un plásmido de expresión (PS) para el antígeno S del virus de la hepatitis B y confirmaron que PS expresaba HBsAg in vitro. Luego inmunizaron ratones BALB/c por separado y descubrieron que PS podía inducir eficazmente inmunidad humoral en ratones. Al mismo tiempo, el péptido codificado por la región pre-S2 de la proteína M también tiene una alta inmunogenicidad cuando se utiliza como vacuna junto con la proteína S, puede superar el fenómeno de la falta de respuesta inmune al HBsAg. la proteína L de longitud completa tiene una mayor inmunogenicidad.
La prevención y el tratamiento de la hepatitis B es principalmente un proceso inmunopatológico. La respuesta inmune del cuerpo al polipéptido preS es de gran importancia para bloquear la reinfección por el VHB. La inmunidad humoral y celular contra los péptidos preS también juega un papel muy importante en la eliminación de virus y la promoción de la recuperación del cuerpo.
Aunque la vacuna contra la hepatitis B de origen sanguíneo tiene un muy buen efecto protector, se prepara a partir de plasma con antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). En teoría, su seguridad no puede cumplir con el 100% de los requisitos. un cierto peligro potencial. Con el desarrollo de la ingeniería genética, el desarrollo de vacunas contra la hepatitis B de segunda generación, es decir, vacunas genéticamente modificadas, ha logrado un gran éxito, y la investigación sobre las vacunas contra la hepatitis B con péptidos sintéticos y las vacunas contra la hepatitis B con ADN también ha logrado grandes avances. en términos de inmunogenicidad y seguridad, y está reemplazando gradualmente a las vacunas derivadas de la sangre.
Las vacunas genéticamente modificadas, también conocidas como vacunas genéticamente recombinantes, clonan genes que codifican antígenos en vectores de expresión. Este ADN plasmídico recombinante se inyecta directamente en los animales para expresar los antígenos correspondientes en los animales y hacer que el cuerpo produzca una inmunidad. La respuesta contra el antígeno se llama tecnología de inmunización con ácido nucleico o vacuna de ADN. El resultado de la inmunización con ADN no es sólo la producción de los anticuerpos correspondientes, sino también la producción de respuestas inmunitarias celulares específicas, lo que es de gran importancia para resistir la infección por VHB.
A través de la evaluación, se demostró que la inmunogenicidad de la vacuna genéticamente modificada es la misma que la de la vacuna de origen sanguíneo, y no existe ningún riesgo potencial causado por la fuente de sangre como materia prima en el reactivo (que puede causar hepatitis B, hepatitis C, SIDA, etc. Riesgo de transmisión de enfermedades por la sangre).
Al principio, se estudió el uso del sistema de expresión procariótica de E. coli para producir vacunas genéticamente modificadas contra la hepatitis B, pero fracasaron debido a los bajos niveles de expresión y los productos inestables. El primer éxito se produjo en levaduras. Valenzuela et al. colocaron el gen HBsAg del subtipo adw bajo el control del promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH) de levadura y expresaron con éxito HBsAg en levadura de cerveza. Desde entonces, los investigadores han seguido el ejemplo y han desarrollado vacunas de ingeniería genética contra la hepatitis B expresadas en levaduras que pueden ingresar al mercado. En los últimos años, han seguido optimizando el sistema de expresión de la levadura. Zhang Wei et al. amplificaron fragmentos de ADNc de diferentes tamaños que contenían la región pre-S del VHB mediante PCR, los clonaron en el plásmido pUC19 y luego los clonaron en el vector cebo de dos híbridos de levadura pGBKT7. El plásmido recombinante se introdujo en la levadura AH109 para su expresión. , y se detectó su expresión. Se descubrió que el producto de expresión activaba tanto el gen indicador como el AH109 de la levadura. Vassileva et al [5i utilizaron el promotor gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAP) para integrar el gen HBsAg en Pichia pastoris para lograr la expresión del gen HBsAg en Pichia pastoris. Bajo el promotor GAP, la proteína antigénica puede expresión continua, experimentos ELISA. muestran que el producto de expresión tiene una inmunogenicidad eficaz. Esta investigación avanza aún más en el desarrollo de sistemas de expresión de levaduras.
Las ventajas del sistema de expresión de levadura son: ① El sistema es relativamente simple, fácil de controlar la producción y tiene una producción estable ② El nivel de expresión es alto ③ El producto de expresión HBsAg se puede ensamblar en la superficie; partículas antigénicas y la inmunogenicidad de las partículas es más de 1.000 veces más fuerte que la del HBsAg monomérico, que es la clave para que el producto de expresión se convierta en una vacuna. Sin embargo, este sistema también tiene desventajas, por ejemplo, el HBsAg expresado por la levadura no se puede secretar, lo que trae más dificultades para el aislamiento y la purificación del producto; la proteína HBsAg expresada por la levadura está sobreglicosilada en el sistema de la levadura, lo que no sólo produce. El producto tiene poca estabilidad, pero también afecta la inmunidad.
(3) La producción y el mecanismo de los anticuerpos contra la hepatitis B
El proceso de producción de anticuerpos es aproximadamente el siguiente: cuando el antígeno ingresa a las células, aumenta el número de folículos linfoides y centros germinales. . Estas zonas contienen linfocitos B específicos en diferentes etapas de diferenciación que responden a antígenos. Tras la estimulación antigénica, estas células contienen citoplasma rico en agregados y un mayor volumen de retículo endoplásmico rugoso. Algunas células B estimuladas se diferencian en células plasmáticas que sintetizan y secretan globulina, que contienen abundante retículo endoplasmático rugoso y gonosomas bien desarrollados.
A medida que las moléculas de inmunoglobulina se mueven a través de los gonosomas antes de la secreción, los residuos de azúcar se unen a las cadenas H. La respuesta de anticuerpos producida en este momento no produce grandes cantidades de anticuerpos. Entre ellos, las células B todavía están dominadas por la IgM. El aumento en el número de células B de recuperación es obvio. Tienen moléculas de inmunoglobulina en la superficie de sus membranas celulares. Cuando se estimulan por segunda vez con antígenos, las células B responden rápidamente a una cantidad mayor. de los antígenos existentes se activa, por lo que la globulina del anticuerpo específico 7S en el suero aumenta rápidamente.
El mecanismo inmunológico importante para que el cuerpo elimine el VHB es: la respuesta inmune celular específica del VHB que aparece en la etapa inicial de la infección inicia el proceso del cuerpo de eliminar el VHB. La forma importante del efecto inmunológico del cuerpo. es un mecanismo de eliminación del VHB no dañino para los hepatocitos mediado por citoquinas, el cuerpo no necesariamente causa daño a las células hepáticas en el proceso de eliminación del VHB. Los hepatocitos pueden producir IFN y otras citocinas en determinadas condiciones, eliminando así directa y proactivamente el VHB a través de los mecanismos anteriores.
1. La respuesta inmune celular específica del VHB que aparece en la etapa temprana de la infección por VHB es un factor clave para que el cuerpo inicie el proceso de eliminación del VHB. La respuesta inmune específica contra el VHB inducida en pacientes con VHB. la infección aguda por VHB es policlonal y policlonal. Con una respuesta inmune celular específica y fuerte, el virus finalmente se elimina en pacientes con infección crónica por VHB, la respuesta inmune celular específica contra el VHB es débil y el cuerpo se encuentra en un estado de tolerancia inmune; al VHB. Los CTL sensibilizados extrahepáticos que aparecen en la sangre periférica en la etapa temprana de la infección por VHB pueden producir citocinas como IFN2γ y TNFα. Cuando fluyen a través de las células endoteliales sinusoidales del hígado con la sangre, los CTL se activan aún más y liberan más citocinas. Además, los antígenos del VHB en la superficie de los hepatocitos pueden activar aún más los CTL específicos del VHB y liberar citocinas nuevamente. Los CTL específicos activan continuamente la proliferación 1 y liberan continuamente grandes cantidades de citocinas. Además, las citocinas producidas por los CTL activados también pueden activar células inmunitarias intrahepáticas no específicas, como las células NK intrahepáticas, las células NK2T, etc., a través de los poros entre las células endoteliales sinusoidales del hígado, produciendo grandes cantidades de IFN2γ, TNFα y otras citocinas. inhibir la replicación del VHB es una función de la amplificación inmune. Por lo tanto, una vez que el CTL se activa mediante la estimulación del antígeno del VHB, se iniciará una reacción en cascada, que amplificará continuamente la señal de estimulación y activará más efectos anti-VHB, logrando en última instancia el propósito de eliminar el VHB. Por lo tanto, la inmunidad celular específica en la etapa temprana de la infección por VHB estimula el mecanismo de eliminación del VHB no citolítico del cuerpo, que es la clave para que el cuerpo inicie el proceso de eliminación del VHB.
2. IFN2γ, TNFα y otras citoquinas actúan sobre los receptores de la superficie de los hepatocitos para eliminar el VHB. Los CTL específicos y las células inmunes no específicas tienen el mismo efecto para lograr la etapa temprana aguda de la hepatitis B. Viral no citolítico. autorización. Su vía efectora más común es producir citocinas efectoras IFN2γ, TNFα, etc., que actúan sobre las células del hígado a través de citocinas para eliminar el VHB. Uno de los mecanismos antivirales conocidos del IFN es unirse a los receptores correspondientes en la superficie de las células diana, induciendo a las células diana a sintetizar proteínas antivirales (AVP), como la proteína quinasa (PKR), 225A sintetasa PRNasa L, proteína Mx, etc. Los estudios han encontrado que el IFN2α puede inducir la producción de proteína MxA en células de cáncer de hígado transfectadas con VHB e inhibir la replicación del ADN del VHB. Guidotti et al. cruzaron ratones transgénicos del VHB con ratones deficientes en el gen de la proteína quinasa (PKR) y el gen de la RNasa L respectivamente para realizar experimentos y observaron que IFN2α/β e IFN2γ pueden inducir la producción de proteínas quinasas para inhibir la replicación del VHB y TNFα. Además de la proteína La completa, además de desestabilizar el ARN del VHB debido a la escisión, también puede inducir un aumento en la actividad de una determinada nucleasa. Bajo este efecto dual, el ARN del VHB eventualmente se degrada, bloqueando así la replicación del VHB.
3. Eliminación del daño de las células diana Los mecanismos virales no son necesarios en el proceso de eliminación del VHB. Cuando se infecta con el VHB, se cree que el CTL no sólo protege el hígado eliminando el virus y controlando la infección, sino que también es la principal célula efectora. que causa daño hepático.
Los hepatocitos no son simplemente células diana pasivas que son atacadas después de la infección por VHB, sino que probablemente sean células efectoras inmunes activas que pueden eliminar directamente el VHB. En determinadas condiciones, los propios hepatocitos pueden producir IFN y otros factores que eliminan directamente el VHB a través de los mecanismos anteriores. Debido a la gran cantidad de hepatocitos, su capacidad antiviral también debería ser muy poderosa, siempre que los hepatocitos puedan producir suficiente IFN y otras citocinas, pueden inhibir la replicación viral y eliminar el VHB de forma no citolítica sin que ello vaya acompañado de daño a las células hepáticas.