¿Cuáles son los principios y procesos básicos de la preparación de anticuerpos monoclonales? cual es el punto
El principio de preparación de anticuerpos monoclonales:
Bajo la estimulación del antígeno, los linfocitos B pueden diferenciarse y proliferar para formar células B con la capacidad de secretar anticuerpos específicos contra este antígeno. y la cantidad son limitadas y es imposible continuar diferenciándose y proliferando. Por lo tanto, la capacidad de producir inmunoglobulinas también es extremadamente pequeña. Esta célula B se fusiona con células de mieloma no secretoras para formar células de hibridoma, que luego se clonan. Esta célula de hibridoma clonada tiene la capacidad de crecer indefinidamente como un tumor y la capacidad de producir linfocitos B que producen anticuerpos específicos. Esta célula de hibridoma clonada puede cultivarse o inyectarse en ratones con una gran cantidad de anticuerpos específicos únicos. Esta tecnología se llama tecnología de anticuerpos monoclonales.
El proceso de preparación de anticuerpos monoclonales:
Animales inmunizados
Los animales inmunizados se utilizan para inmunizar ratones con el antígeno diana, de modo que los ratones produzcan linfocitos B sensibilizados. proceso. Generalmente se utilizan ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad, y las inyecciones de inmunización se llevan a cabo según el plan de inmunización preestablecido. Los antígenos ingresan a los órganos inmunes periféricos a través de la circulación sanguínea o linfática, estimulan los clones de linfocitos B correspondientes, se activan, proliferan y se diferencian en linfocitos B sensibilizados.
Fusión celular
Utilice gas dióxido de carbono para matar a los ratones, extraiga el bazo asépticamente, exprímalo y tritúrelo en un plato para preparar una suspensión de células del bazo. Las células de mieloma singénicas preparadas y los esplenocitos de ratón se mezclaron en una determinada proporción y se añadió el agente promotor de la fusión polietilenglicol. Bajo la acción del polietilenglicol, varios linfocitos pueden fusionarse con células de mieloma para formar células de hibridoma.
Cultivo selectivo
El propósito del cultivo selectivo es detectar células de hibridoma fusionadas y generalmente se utiliza el medio de cultivo selectivo HAT. En el medio HAT, las células de mieloma no fusionadas carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa y no pueden utilizar la vía de rescate para sintetizar ADN y morir. Aunque los linfocitos no fusionados poseen hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa, ellos mismos no pueden sobrevivir durante largos períodos de tiempo fuera del cuerpo y mueren gradualmente. Sólo las células de hibridoma fusionadas pueden sobrevivir y proliferar en el medio HAT porque han adquirido la hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa de los esplenocitos y tienen las características de las células de mieloma que pueden proliferar indefinidamente.
Selección y clonación de clones positivos para hibridoma
Sólo unas pocas de las células de hibridoma cultivadas en medio HAT secretan anticuerpos monoclonales específicos predeterminados. Por lo tanto, es necesario realizar un cribado y clonación. El método de dilución limitante se utiliza habitualmente para el cultivo clonal de células de hibridoma. Se utilizan métodos inmunológicos sensibles, rápidos y específicos para detectar células de hibridoma positivas que puedan producir los anticuerpos monoclonales necesarios y realizar la expansión clonal. Después de una identificación exhaustiva del tipo, subclase, especificidad, afinidad, epítopo de inmunoglobulina para reconocer el antígeno y su peso molecular del anticuerpo monoclonal secretado, se congela de manera oportuna.
Preparación a gran escala de anticuerpos monoclonales
La preparación a gran escala de anticuerpos monoclonales utiliza principalmente métodos de inducción animal in vivo y métodos de cultivo in vitro.
(1) Método de inducción in vivo: a los ratones BALB/c se les inyectó primero por vía intraperitoneal 0,5 ml de parafina líquida o fitano para el pretratamiento. 1-2 semanas después, se inocularon células de hibridoma por vía intraperitoneal. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad abdominal de los ratones y producen y secretan anticuerpos monoclonales. Aproximadamente 1 o 2 semanas después, se puede observar que el abdomen de los ratones aumenta de tamaño. Se puede obtener una gran cantidad de anticuerpos monoclonales extrayendo líquido ascítico con una jeringa.
(2) Método de cultivo in vitro Coloque las células de hibridoma en una botella de cultivo para su cultivo. Durante el proceso de cultivo, las células de hibridoma producen y secretan anticuerpos monoclonales. Se recoge el sobrenadante del cultivo y las células y sus restos se eliminan mediante centrifugación para obtener los anticuerpos monoclonales necesarios. Sin embargo, la cantidad de anticuerpos producidos por este método es limitada. Siguen surgiendo varias tecnologías y dispositivos de cultivo nuevos, que aumentan considerablemente la producción de anticuerpos.
La importancia de la preparación de anticuerpos monoclonales:
Se utiliza en los siguientes experimentos de ciencias biológicas y tiene valor médico.
(1) Reacción de precipitación: reacción de precipitación
p>(2) Prueba de aglutinación: hemaglutinación
(3) Método radioinmunológico para detectar complejos inmunes
(4) Citómetro de flujo: utilizado para análisis celular Tipo y separación celular.
(5) ELISA y otras pruebas inmunológicas
(6) Biosensor BIAcore: detecta Ab-Ag o afinidad con proteínas.
(7 ) Western blotting
(8) Inmunoprecipitación:
(9) Cromatografía de afinidad: separación de proteínas
(10) Células separadas por perlas magnéticas
(11) Diagnóstico y tratamiento de enfermedades clínicas;