Principio del secuenciador BGI
En primer lugar, BGI no me dio dinero. Recientemente utilicé la secuenciación de BGI y la estudié.
La tecnología de secuenciación de BGI se originó a partir de la secuenciación cPAL (ligadura combinatoria de sonda y anclaje) de CG (Complete Genomics).
La construcción de biblioteca para la secuenciación cPAL de CG se llama DNB (DNA Nanoballs), que utiliza RCA (Rolling Circle Replication) para amplificar el ADN en una estructura helicoidal lineal. La ventaja de este método de construcción de bibliotecas es que todas las plantillas de amplificación son fragmentos insertados originalmente, por lo que los errores generados por la PCR no se acumularán y solo afectarán a la secuencia amplificada. Si se produce un error en la amplificación durante la secuenciación como ILLUMINA, el fragmento erróneo se utilizará como plantilla en la amplificación posterior, lo que provocará una acumulación de errores.
Una vez construida la biblioteca, se agrega al chip de secuenciación. El chip de secuenciación tiene sitios de unión a DNB y un sitio se une a un DNB.
Luego se realiza la secuenciación cPAL. Cada ronda de secuenciación agrega primero una secuencia de anclaje que coincide con el adaptador y luego agrega una gran cantidad de sondas con solo una base marcada con fluorescencia. La posición de la base marcada con fluorescencia en la sonda está determinada por la posición que se va a secuenciar. , para detectar Si la primera base es la primera base, etiquete solo la primera base de la sonda. Si desea detectar la quinta base, etiquete de forma fluorescente la quinta base de la sonda. Una vez unida la sonda, la sonda no unida se elimina por lavado y luego se detecta la señal correspondiente para obtener la información de la secuencia. Luego se eliminan todas las sondas unidas y las secuencias de anclaje y comienza la siguiente ronda de secuenciación. En comparación con la secuenciación SBS de ILLUMINA, la ventaja es que la siguiente base no depende de la base anterior, por lo que los errores de secuenciación son más aleatorios.
El instrumento BGISEQ-500 posterior utilizó tecnología cPAS (síntesis combinatoria de sonda-ancla) mejorada de cPAL. No he encontrado el material apropiado para los detalles técnicos específicos de este cPAS, pero supongo que debería ser SBS. similar a ILLUMINA Los amigos que tengan información pueden compartirla.
MGISEQ-2000 todavía usa DNB para construir la biblioteca, pero usa la nueva tecnología CoolMPS para la secuenciación. Se trata de una tecnología basada en anticuerpos en la que la etiqueta fluorescente está en el anticuerpo en lugar de en las bases de dNTP (de ahí el nombre de dNTP fríos). Esto resuelve el problema de que la adición de grupos fluorescentes a los dNTP en la plataforma ILLUMINA provocará "cicatrices" en el ADN que afectarán la precisión de la secuenciación posterior.
La tecnología CoolMPS se muestra a continuación. En comparación con ILLUMINA SBS, la principal mejora es marcar el grupo fluorescente del anticuerpo, lo que permite que el anticuerpo se una específicamente a la base, de modo que la secuenciación sea más precisa. Además, los anticuerpos pueden portar múltiples grupos fluorescentes para fortalecer la señal de fluorescencia.
Entonces, ¿cuál es el proceso de secuenciación de extremos emparejados usando CoolMPS después de la construcción de la biblioteca DNB? Como se muestra a continuación, A realiza la unión del cebador y la secuenciación de Read1; B continúa sintetizando la secuencia después de completar Read1 hasta el extremo 5' de la siguiente secuencia.
C Después de que el extremo 3' de la secuencia recién sintetizada alcanza el extremo 5' de la siguiente secuencia, el extremo 5' se reemplaza para formar una bifurcación. D Se realiza la secuenciación Read2 en la bifurcación.
La siguiente figura muestra que las 2 primeras bases de la secuenciación CoolMPS tienen poco impacto en la señal de la base probada.
Referencias
Chen, Fei, et al. "La historia y los avances de los terminadores reversibles utilizados en las nuevas generaciones de tecnología de secuenciación". -40.
Drmanac, Snezana, et al. "CoolMPS?: Secuenciación masiva paralela avanzada utilizando anticuerpos específicos para cada nucleobase natural". bioRxiv (2020).
Sitio web oficial de BGI