Diseño y optimización del sistema de sondas TaqMan para PCR cuantitativa
Paso uno: en el primer paso de encontrar y comparar genes objetivo, podemos utilizar secuencias del banco de genes NCBI y el software DNAstar para encontrar y comparar el ADN o ARN objetivo. Creo que muchas personas han hecho esto al analizar la secuenciación. informes. Lo que hay que tener en cuenta en este paso es garantizar que la secuencia que se analiza esté en un cóntig (cóntig, es decir, la superposición de fragmentos de ADN adyacentes en ciertas regiones del cromosoma).
Paso 2: Si otras condiciones son iguales, entonces se puede decir que el segundo paso: el diseño de cebadores y sondas es la clave para el éxito o el fracaso de la PCR cuantitativa. Los siguientes principios básicos se han resumido a través de varias experiencias:
Primero seleccione la sonda y luego diseñe el cebador para que esté lo más cerca posible de la sonda.
La secuencia seleccionada debe ser muy específica, e intentar seleccionar el fragmento de amplificación con la estructura secundaria más pequeña, porque la estructura secundaria afectará a la eficiencia de la reacción y dificultará la amplificación de la enzima. Se recomienda detectar primero la estructura secundaria. Si no se pueden evitar las estructuras secundarias, la temperatura de recocido debe aumentarse en consecuencia.
La longitud de amplificación no debe exceder los 400 pb, e idealmente debería estar entre 100-150 pb. Cuanto más corto sea el fragmento amplificado, más fácil será obtener una reacción de amplificación eficiente. Los fragmentos amplificados más cortos también facilitan la garantía de un análisis coherente.
Mantenga el contenido de GC entre el 20% y el 80%. Las áreas ricas en GC son propensas a reacciones no específicas, lo que conducirá a una eficiencia de amplificación reducida y señales no específicas en el análisis de tintes fluorescentes.
Para garantizar eficiencia y reproducibilidad, debemos evitar secuencias de nucleótidos repetidas, especialmente G (no puede haber cuatro G consecutivas).
Los cebadores y las sondas se emparejan entre sí para evitar la formación de dímeros y estructuras en horquilla.
La selección de secuencia debe ser en partes conservadas del gen
Evitar la formación de cuatro o más pares consecutivos entre los propios cebadores o con los cebadores, y evitar la formación de bucles por parte de los cebadores. imprimaciones propias Estructura de horquilla.
Los cebadores típicos tienen de 18 a 24 nucleótidos de longitud. Los cebadores deben ser lo suficientemente largos para garantizar la unicidad de la secuencia y reducir la posibilidad de que la secuencia exista en sitios de secuencia no objetivo. Sin embargo, los cebadores de más de 24 nucleótidos no implican una mayor especificidad. Las secuencias más largas pueden hibridarse con secuencias no coincidentes, lo que reduce la especificidad, y son más lentas que las secuencias cortas, lo que reduce el rendimiento.
El valor de Tm es 55-65 ℃ (porque la actividad exonucleasa es mayor a 60 ℃) y el contenido de GC es 40%-60%.
Evitar que la diferencia de TM entre primers supere los 2℃
Evitar la presencia de la base A en el extremo 3' del primer, y evitar la presencia de tres o más bases consecutivas en el extremo 3' del cebador de la misma base.
Para evitar la amplificación del genoma, lo mejor es diseñar cebadores que abarquen dos exones.
La tecnología de sonda Taqman requiere una longitud de fragmento de 50 pb-150 pb.
El final del cebador (últimos 5 nucleótidos) no puede superar los 2 G y c.
Ubique la sonda lo más cerca posible del cebador aguas arriba.
La longitud de la sonda debe ser de 15 a 45 pb (preferiblemente de 20 a 30 pb) para garantizar la especificidad de unión.
Detectar el plegamiento del ADN y la estructura secundaria de la sonda
El valor de Tm es 65-70 ℃, generalmente 5-10 ℃ más alto que el cebador (al menos 5 ℃), y el contenido de GC es del 40% al 70%.
El extremo 5' de la sonda debe evitar la guanina G, porque 5'G tendrá un efecto de extinción. Incluso si se corta, seguirá teniendo un efecto de extinción.
En toda la sonda, el contenido de base c es significativamente mayor que g; un contenido alto de g reducirá la eficiencia de la reacción, por lo que se debe seleccionar otra hebra como sonda.
Para garantizar la especificidad de la sonda cebadora, lo mejor es verificar la secuencia diseñada en blast. Si existen regiones complementarias no específicas, se recomienda rediseñar la sonda cebadora.
Se evita g en el extremo 5’ de la sonda. Incluso si la sonda se hidroliza en una sola base, la base G conectada al grupo informador aún puede apagar la señal de fluorescencia del grupo.
El valor Tm debe ser 65-67 ℃.
Intente acortar la sonda Taqman MGB tanto como sea posible, pero la longitud de la sonda no debe ser inferior a 13 pb.
Intenta evitar bases repetidas, especialmente bases G, y evita cuatro o más repeticiones G.
En principio, mientras exista una mutación de base en la sonda MGB, la sonda MGB la detectará (la sonda MGB no se hibridará con el fragmento diana y no generará una señal fluorescente). Por lo tanto, en la detección de SNP, para detectar mutaciones, es decir, Taqman MGB no se hibrida con el fragmento objetivo y no produce una señal fluorescente, el sitio de mutación de la sonda debe colocarse en el medio 1/3 tanto como posible.
Nota: Para cumplir con los cuatro requisitos anteriores, el sitio de mutación de la sonda se puede mover al extremo 3', pero el sitio de mutación está al menos a 2 bases del extremo 3' (es decir, es decir, las dos últimas bases de las bases de la sonda deben estar absolutamente conservadas) antes de que se pueda realizar la detección de SNP. Por el contrario, si desea realizar una detección similar, debe encontrar la región del fragmento conservado y no debe haber sitios de mutación en la sonda. Aunque la sonda tiene sólo 13 pb, todavía no está completamente conservada.
Hay varias mutaciones y el sitio de la mutación debe estar cerca del extremo 5' de la sonda, de modo que incluso si hay una mutación, la sonda pueda hibridarse con el fragmento objetivo y generar una señal fluorescente. Otro enfoque consiste en diseñar sondas degeneradas que puedan detectar incluso mutaciones.
Paso 3: Encontrar una empresa de confianza para sintetizar cebadores y sondas. En general, la síntesis de cebadores es familiar para todos y el precio es relativamente barato (especialmente en los últimos dos años), mientras que las sondas son relativamente caras. Generalmente, la síntesis de la sonda Taqman oscila entre 65.438+0.000 y 5.000 yuanes (los diferentes requisitos de síntesis tienen diferentes precios); y este es solo el precio, la síntesis de secuencias es básicamente la misma que la síntesis de cebadores.
Pasos 4, 5 y 6: Excepto por la adición de sondas Taqman, el sistema de reacción de PCR cuantitativa general no es muy diferente del método de PCR general. La otra diferencia es que se divide en pasos. Cabe señalar que:
La enzima de amplificación es preferiblemente una enzima de inicio en caliente.
Es necesario optimizar las concentraciones de cebadores y sondas. Se recomienda optimizar la concentración de 50 nM a 900 nm, normalmente 200 nM (tenga en cuenta que la sonda debe protegerse de la luz.
Del mismo modo, también es necesario optimizar la dosis de Mg+ y enzima. La concentración de reacción recomendada de la enzima es 1,25-1,5 U (50 ul).
La cantidad de plantilla de ADN agregada suele ser inferior a 100 ng, ya que los diferentes tipos de plantillas de ADN contienen diferentes números de copias del gen objetivo, gradiente. Se puede realizar una dilución si es necesario para determinar la cantidad óptima de adición. Si se va a realizar el segundo paso de la reacción de RT-PCR de dos pasos, la cantidad de solución de reacción de RT utilizada como plantilla de ADN en el primer paso. no debe exceder el 10% del volumen total de la solución de reacción de PCR. p>
Además, aunque los parámetros de ciclado se determinan después del diseño del cebador y la sonda, a veces es necesario optimizarlos.
Paso 7. : En el análisis de datos, la curva estándar generalmente se compone de diferentes concentraciones. Luego se calcula el valor Ct de la muestra estándar. La ecuación de pendiente se puede utilizar para verificar la eficiencia de la PCR. Para una eficiencia de PCR del 100 %, la pendiente ideal es 3,32. La eficiencia de amplificación basada en PCR es del 90% al 100% (100% significa que para cada ciclo, el número total de plantillas aumentará al doble que el tiempo anterior). El análisis de regresión lineal de todas las curvas estándar requiere un coeficiente de correlación alto (R2). ≥0,99), para que el proceso y los datos experimentales puedan considerarse creíbles. Usando esta ecuación, podemos calcular la cantidad de plantilla inicial de muestras desconocidas. La mayoría de los instrumentos de PCR cuantitativos tienen un software que puede calcular automáticamente la cantidad de muestras desconocidas. la curva estándar. Cantidad de plantilla inicial.
Hay dos métodos básicos: cuantificación absoluta y cuantificación relativa. Los investigadores deben elegir en función de sus propósitos experimentales. La cuantificación absoluta se refiere a comparar muestras desconocidas con la curva estándar. El estándar es una muestra de ADN con una concentración absoluta conocida. Cabe señalar que la precisión de la cuantificación absoluta es relativa a la precisión del estándar se refiere a la comparación de dos o más genes entre sí y el resultado. es una proporción, no se detectó un número exacto.
Además, debido a ciertas diferencias en el proceso de reacción de diferentes muestras, además de realizar una curva estándar para la cuantificación, también es necesario diseñar una. El gen de referencia interno con un nivel de expresión relativamente estable para estandarizar los resultados es la β-actina y la gliceraldehído trifosfato deshidrogenasa (GAPDH), así como la ciclofilina, el ARN 18sr, la fosfoinositida quinasa, la β-microglobulina y el β-glucósido. Enzimas, hipoxantina ribosiltransferasas, receptores de transferencia, etc. Cabe señalar que estos genes se verán afectados por las condiciones de reacción. Al diseñar estudios de expresión cuantitativa, es necesario garantizar la calidad de los genes de control iniciales, y los investigadores rigurosos los seleccionarán. La media geométrica de una serie de resultados de cuantificación de genes de referencia interna se utiliza para estandarizar los datos cuantitativos.
Otra cuestión es cómo juzgar la calidad de los datos obtenidos. En cuanto a la curva de amplificación, la conclusión empírica. es:
"1. En general, el punto de inflexión de la curva es claro, el período exponencial es obvio, el paralelismo general de la curva de amplificación es excelente, la línea de base es plana y no hay fenómeno ascendente, y el período exponencial de la curva de amplificación de muestras de baja concentración es obvio.
La concentración de Mg2+ es el factor clave que afecta la actividad de la enzima Taq. Una concentración demasiado baja de Mg2+ afectará la actividad óptima de la enzima Taq, mientras que una concentración demasiado alta de Mg2+ aumentará la amplificación no específica.
En términos generales, para reacciones de qPCR en tiempo real que utilizan ADN o ADNc como plantilla, la concentración de Mg2+ debe ser de 2 ~ 5 mmol/L, y para reacciones directas que utilizan ARNm como plantilla, la concentración de Mg2+ debe ser 4 ~ 8 mmol/L.
La concentración de la plantilla debe seleccionarse en función del valor de Ct. En general, es adecuado mantener el valor de Ct entre 15 y 30 semanas. Si es mayor que 30, se debe utilizar una concentración de plantilla más alta. Si el valor de Ct es inferior a 15, se debe reducir la concentración de la plantilla. Si el investigador está realizando experimentos por primera vez, debe seleccionar una serie de concentraciones de dilución de plantillas para realizar experimentos y seleccionar la concentración de plantilla más adecuada.
Se utiliza para reacciones qPCR en tiempo real de algunas muestras con componentes complejos (suelo, sedimento, etc.). ), la plantilla de ADN extraída generalmente contiene más humus y otras sustancias, lo que inhibirá la reacción de PCR, lo que provocará una disminución en la eficiencia de la amplificación, reduciendo así la precisión cuantitativa del gen objetivo.
Normalmente, la plantilla de ADN se diluye para eliminar la inhibición de la PCR, pero en algunos casos, debido a la pequeña cantidad de plantilla, el método de dilución no es adecuado, por lo que se requiere una purificación adicional de la plantilla.
Una concentración de cebador demasiado baja provocará una reacción incompleta. Si la concentración del cebador es demasiado alta, se producirán desajustes y se producirán productos de amplificación no específicos. Para la mayoría de las reacciones de PCR, 0,5 μmol/L es una concentración de cebador adecuada. Si los resultados experimentales iniciales no son ideales, puede ajustarlos entre 0,3 ~ 1,0 μ mol/L.
La pureza de los cebadores utilizados en qPCR en tiempo real debe alcanzar al menos el nivel PAGE si los utiliza. Imprimadores de nivel OPC, los resultados serán diferentes y precisos.
Por lo general, el pico de la curva de fusión del producto de PCR del gen objetivo aparece entre 80 ℃ y 90 ℃. Cuando el pico de baja intensidad de fluorescencia aparece en la curva de fusión entre 70 ℃ y 80 ℃. , lo que indica que se produjeron dímeros de cebador en la reacción de qPCR en tiempo real.
En este momento, primero debemos determinar la causa de los dímeros de cebador. Si los dímeros de cebador no aparecen en muestras con un alto número de copias del gen diana, sino que solo existen en muestras con bajas copias del gen diana, entonces los dímeros de cebador aparecen porque el contenido del gen diana en la muestra es demasiado bajo, lo que da como resultado una autocoincidencia. Podemos eliminar los dímeros de cebadores aumentando la cantidad de plantilla o reduciendo la cantidad de cebadores.
Otra forma de eliminar los dímeros del cebador es aumentar la temperatura de recocido, pero esto no es necesariamente efectivo. Se recomienda que antes de realizar qPCR en tiempo real, sea mejor utilizar PCR con gradiente de temperatura para detectar si los cebadores formarán dímeros y determinar la temperatura de recocido adecuada.
Al dibujar la curva estándar del gen diana, a menudo nos encontramos con el problema de una gran desviación en la eficiencia de la amplificación.
Se pueden agregar 500 μg/ml de BSA (albúmina sérica bovina) al sistema de reacción para estabilizar las plantillas de ácido nucleico de baja concentración y mejorar la eficiencia de la amplificación.
La eficiencia de amplificación de los productos de PCR cortos es mayor que la de los productos de PCR largos porque los productos cortos se desnaturalizan más fácilmente a 95 °C, lo que permite que los cebadores y las sondas se unan más eficazmente a sus secuencias complementarias durante la hibridación. etapa, reduciendo el genoma La contaminación causada por la amplificación acorta el tiempo de amplificación.
Aumentar la temperatura de hibridación puede mejorar la especificidad y la eficiencia de amplificación de la reacción de PCR. Si es necesario, la temperatura de hibridación se puede aumentar por encima de 60 °C, se puede eliminar la etapa de extensión de 72 °C y la hibridación y la extensión se pueden combinar en una sola para garantizar la eficiencia de amplificación del gen diana.
Si la eficiencia de amplificación de la curva estándar es superior al 100%, probablemente se deba a errores operativos durante el proceso de dilución del gradiente estándar, lo que da como resultado estándares inexactos de baja concentración que se han diluido con más frecuencia. La curva estándar se debe volver a dibujar después de diluir nuevamente el estándar.
Referencia: Biología