PCR cuantitativa

En más de 30 años desde 1985 hasta la actualidad, el análisis PCR ha experimentado el desarrollo de tres generaciones de tecnología. La primera generación de tecnología de PCR tradicional utiliza electroforesis en gel de agarosa para realizar análisis cualitativos de los productos de PCR. La tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia de segunda generación agrega grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR, utiliza la acumulación de señales fluorescentes para monitorear el proceso de PCR en tiempo real y finalmente usa el valor Cq para analizar genes cuantitativamente. La tecnología de PCR digital de tercera generación realiza la amplificación de una sola molécula de moléculas de ácido nucleico limitando la dilución de la solución de reacción de PCR y, finalmente, adopta el método de punto final para detectar la señal fluorescente de gotas positivas. Las gotas con señales fluorescentes se interpretan como. 1; las gotas sin señales fluorescentes son microgotas leídas como 0, por lo que la técnica se denomina PCR digital.

La tecnología PCR está en constante evolución pero nunca ha desaparecido de nuestra vista. Ahora ha penetrado en varios niveles de investigación en el campo de la biología molecular. Especialmente durante la pandemia mundial de este año, se ha demostrado el poder de la tecnología PCR. Entonces, en la investigación científica, ¿cómo deberíamos elegir entre la PCR tradicional, la PCR cuantitativa de fluorescencia y la PCR digital?

En primer lugar debemos tener claro que todos los fundamentos de la tecnología PCR de tercera generación provienen de los principios básicos de las reacciones PCR y de las tres etapas importantes de las reacciones PCR, que son fase exponencial, fase lineal y fase de meseta.

Fase exponencial

En la fase exponencial, la cantidad de producto de PCR aumenta aproximadamente dos veces en cada ciclo (asumiendo una eficiencia de reacción del 100%). La reacción de amplificación en esta fase es altamente específica y. Preciso.

Fase lineal (alta variabilidad)

A medida que los componentes del sistema de reacción de PCR se van consumiendo, uno o más componentes limitan la reacción, haciendo que la reacción comience a ralentizarse, y cada Los productos de PCR del ciclo ya no se duplican.

Meseta

La reacción se detiene y no se producen más productos. Debido a que cada muestra tiene una cinética de reacción diferente, cada reacción entrará en una meseta en un momento diferente, y estas diferencias se pueden observar durante la meseta.

PCR tradicional

La PCR tradicional analiza el producto final de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2). En la Figura 3, los tres pocillos de reacción contienen la misma cantidad de plantilla de ADN, pero las señales de fluorescencia generadas después de alcanzar la fase de meseta son diferentes, lo que indica que las cantidades de productos de amplificación son diferentes (debido a cambios en la cinética de reacción). Esto también muestra que existe variabilidad en los resultados de la medición de meseta de PCR tradicional, y que la cantidad de ADN producida puede no reflejar necesariamente la situación inicial, por lo que no se puede realizar la cuantificación.

PCR cuantitativa fluorescente

También en la Figura 3, se encuentra que durante la fase exponencial, las curvas de amplificación de los tres pocillos de reacción se superponen completamente, lo que indica que la detección durante la fase exponencial ser más preciso. Se puede lograr una cuantificación más precisa. La línea de umbral es un valor de intensidad de fluorescencia cuando la intensidad de fluorescencia del producto amplificado excede el fondo. El número de ciclos a través de los cuales la muestra alcanza este valor de intensidad de fluorescencia se denomina valor Cq. Al comparar el valor Cq de una muestra de concentración desconocida con una serie de estándares, se puede determinar con precisión la cantidad de ADN molde en una reacción desconocida.

PCR digital

La PCR digital distribuye aleatoriamente la muestra de ADN en unidades de reacción independientes, y cada unidad de reacción puede contener o no una o más copias de la molécula objetivo, al fin y al cabo, reacción independiente. Las unidades se amplifican en paralelo, la señal de fluorescencia negativa o positiva de cada unidad de reacción se detecta y analiza estadísticamente, y el número de copias de la muestra original se puede calcular sin referencia a estándares o controles endógenos, y no se requiere curva estándar.

Elección entre PCR tradicional, PCR cuantitativa por fluorescencia y PCR digital

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Referencias:

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