Cómo detectar E. coli

Reglas de operación para la determinación de coliformes (*** Centro de pruebas del Instituto de Investigación)

Coliformes se refiere a un grupo de bacterias que pueden fermentar la lactosa, producir ácido y gas, y son aeróbicas y facultativas. Bacilos anaerobios Gram negativos. Esta bacteria proviene principalmente de heces humanas y animales, por lo que se utiliza como indicador de contaminación fecal para evaluar la calidad higiénica de los alimentos e inferir si existe posibilidad de contaminación de bacterias patógenas intestinales en los alimentos.

El número de coliformes en los alimentos se expresa como el número más probable (MPN) de coliformes en 100mL (g) de muestra.

1 Equipos y materiales

1.1 Termostato: 36±1℃.

1.2 Refrigerador: 0～4℃.

1.3 Baño María a temperatura constante: 44,5±0,5℃.

1.4 Saldo.

1.5 Microscopio.

1.6 Homogeneizador o mortero.

1.7 Placa de Petri: el diámetro es de 90 mm.

1.8 Tubo de ensayo.

1.9 Paja.

1.10 Frasco de boca ancha o matraz Erlenmeyer: la capacidad es de 500mL.

1.11 Cuentas de cristal: unos 5mm de diámetro.

1.12 Diapositiva.

1.13 Lámpara de alcohol.

1.14 Gradilla para tubos de ensayo.

2 Medios de cultivo y reactivos

2.1 Tubo de fermentación de sales biliares de lactosa: Según lo dispuesto en el 4.9 del GB 4789.28.

2.2 Placa de agar eosina-azul de metileno: Según lo establecido en 4.25 en GB 4789.28.

2.3 Tubo de fermentación de lactosa: Según lo dispuesto en el 4.10 del GB 4789.28.

2.4 Caldo EC: Según lo establecido en 4.11 en GB 4789.28.

2.5 Diluyente tampón fosfato: Según lo establecido en 3.22 en GB 4789.28.

2.6 Suero fisiológico.

2.7 Solución de tinción de Gram: Según lo establecido en 2.2 en GB 4789.28.

3 Pasos de la operación

3.1 Dilución de la muestra

3.1.1 Utilice una operación aséptica para colocar 25 ml (o g) de la muestra en una solución fisiológica estéril de 225 ml. Coloque agua salada u otro diluyente en una botella de vidrio esterilizada (se coloca una cantidad adecuada de cuentas de vidrio en la botella) o en un mortero esterilizado, y agítelo o tritúrelo completamente para obtener una dilución uniforme de 1:10. Lo mejor es utilizar un homogeneizador para procesar la muestra sólida a una velocidad de 8 000-10 000 r/min durante 1 minuto para obtener una dilución uniforme de 1:10.

3.1.2 Utilice una pajita estéril de 1 ml para absorber 1 ml de la dilución 1:10, inyéctelo en un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solución salina estéril u otros diluyentes, agite el tubo de ensayo y mezcle para obtener un resultado de 1 ml. : Diluyente al 100.

3.1.3 Tome otra pajita estéril de 1 ml y realice diluciones incrementales de 10 veces según la operación anterior. Para cada dilución incremental, utilice una pajita estéril de 1 ml.

3.1.4 De acuerdo con los requisitos de las normas de higiene alimentaria o la estimación de la contaminación de la muestra problema, seleccionar tres diluciones e inocular 3 tubos por cada dilución.

3.2 Prueba de fermentación de lactosa

Inocular la muestra a analizar en el tubo de fermentación de lactosa y sales biliares. Si el volumen de inoculación es superior a 1 mL, utilizar lactosa de doble material y. tubo de fermentación de sales biliares Si el volumen de inoculación es de 1 ml o menos, utilice un tubo de fermentación de sales biliares de lactosa de doble material, utilizando tubos de fermentación de lactosa y sales biliares de alimentación única. Inocular 3 tubos para cada dilución, colocar en una incubadora a 36±1°C e incubar durante 24±2 horas. Si todos los tubos de fermentación de lactosa y sales biliares no producen gas, se puede informar como coliforme negativo. producción, luego siga el procedimiento a continuación.

3.3 Cultivo de aislamiento

Transfiera los tubos de fermentación productores de gas a placas de agar eosina azul de metileno, colóquelos en una incubadora a 36 ± 1 °C y cultive durante 18-24 horas. luego sáquelo, observe la morfología de la colonia y realice tinciones de Gram y pruebas de confirmación.

3.4 Prueba de confirmación

En la placa anterior, elija 1-2 colonias coliformes sospechosas para la tinción de Gram y, al mismo tiempo, inocule el tubo de fermentación de lactosa y colóquelo a 36 ± 1 ℃ Incubar en la incubadora durante 24 ± 2 h y observar la producción de gas. Las bacterias libres de bacilos que producen gas en los conductos de lactosa y son negativas en la tinción de Gram pueden considerarse coliformes positivas.

3.5 Informe

De acuerdo con el número de tubos confirmados como positivos para coliformes, consulte la tabla de recuperación de NMP e informe el valor de NMP de coliformes por 100 ml (g).

4 Coliformes fecales

4.1 Utilice un asa de inoculación para transferir todos los cultivos de tubos de fermentación de sales biliares y lactosa que producen gas (ver 3.2) al tubo de caldo EC, colóquelo en un recipiente de 44,5 ± Baño de agua a 0,2 ℃ (la superficie del agua en el baño de agua debe ser superior al nivel del caldo EC) e incubar durante 24 ± 2 horas. Después de la incubación, si todos los tubos de caldo EC no producen gas, se puede informar como negativo; si hay producción de gas, transfiera todos los tubos de caldo EC productores de gas a placas de agar eosina azul de metileno y cultívelos durante 18 a 24 horas. Si hay colonias típicas en las placas, se confirma que son positivas para el grupo coliforme fecal.

4.2 Informe de resultados

De acuerdo con el número de tubos positivos confirmados como coliformes fecales, verifique la tabla de recuperación de NMP e informe el valor de NMP de coliformes fecales por 100 ml (g).