¡Echa un vistazo rápido a los planes experimentales de cada grupo de sujetos para añadir material al artículo!
Es nuevamente la temporada para que los estudiantes de maestría y doctorado en colegios y universidades se arremanguen y publiquen artículos como forma breve y rápida, los artículos biográficos son amados por la mayoría de los investigadores científicos. Simplemente utilicé la palabra clave "TCGA" en pubmed para contar las publicaciones de SCI en los últimos diez años y descubrí que desde 2010, el número de publicaciones de SCI de biotecnología ha aumentado exponencialmente de 15 a más de 2700 artículos por año. Sorprendentemente, en lo que va de 2020 se han publicado 1.212 artículos. ¿Cómo puede surgir de repente un número tan grande de artículos biográficos y ganarse el favor de los críticos? Recientemente, muchas personas se han quejado de que cada vez hay menos revistas para envíos a revistas puramente biográficas, y la tendencia de las revistas para envíos ha cambiado demasiado rápido. Los revisores han informado que se requiere verificación funcional y pruebas adicionales. Desde este punto de vista, agregar algunos materiales experimentales a los artículos biotecnológicos es la tendencia general de la SCI biotecnológica. Entonces, ¿cuáles son los métodos de verificación experimental de los marcadores examinados por cada grupo? En este número, le proporcionaré varios métodos de verificación experimental de marcadores ómicos para su referencia.
Fuente: Pubmed
Para facilitar la rápida comprensión de todos, consulté una gran cantidad de información y presenté soluciones ómicas comunes y pasos experimentales concisos en forma de texto e imágenes. Los compartiremos en este número. Métodos de detección de marcadores para los cuatro grupos de genómica, proteómica, metabolómica y transcriptómica, no hace falta decir tonterías, vayamos directamente a lo esencial.
1. Experimento de verificación de marcadores genómicos
1. Expresión génica
La PCR cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR) se utiliza cuando la cantidad de muestra es pequeña o muy condiciones preciosas para estudiar patrones de expresión genética. Las principales ventajas de este método son un amplio rango, alta sensibilidad, alta precisión, sin pasos de procesamiento posterior a la PCR, evitando la contaminación cruzada, alta tasa de salida y la capacidad de realizar múltiples detecciones. Específicamente, el análisis cuantitativo y cualitativo de la plantilla inicial se logra mediante la detección en tiempo real de la señal de fluorescencia de cada producto del ciclo en la reacción de amplificación por PCR. En la reacción de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, se introduce una sustancia química fluorescente a medida que avanza la reacción de PCR, los productos de la reacción de PCR continúan acumulándose y la intensidad de la señal de fluorescencia también aumenta proporcionalmente. Después de cada ciclo, se recoge una señal de intensidad de fluorescencia, se detectan cambios en la cantidad de producto mediante cambios en la intensidad de fluorescencia y finalmente se obtiene una curva de amplificación de fluorescencia. Para ideas experimentales, consulte la referencia [1].
Materiales experimentales
Tejidos y células frescos y congelados, sangre o plasma fresco y congelado, etc.
Los métodos de detección de la expresión génica también incluyen: PCR [2 ], RT-PCR[3].
2. Detección de metilación
La PCR específica de metilación (MSP) es un ADN altamente sensible que no está restringido por enzimas de restricción. Tecnología de detección de metilación. Por lo general, se diseñan dos pares de cebadores, un par de cebadores MSP amplifica el molde de ADN tratado con bisulfito y el otro par amplifica el fragmento no metilado. Si el primer par de cebadores puede amplificar un fragmento, significa que hay metilación en el sitio de detección; si el segundo par de cebadores puede amplificar un fragmento, significa que no hay metilación en el sitio de detección. Para ideas experimentales, consulte la referencia [4].
Materiales experimentales
Células o tejidos frescos, congelados, incluidos en parafina, etc.
Otras técnicas para la detección de metilación también incluyen: tratamiento con bisulfito + secuenciación [5 ], análisis combinado de endonucleasa de restricción con bisulfato de sodio (COBRA) [6], etc.
2. Experimento de verificación de marcadores proteómicos
La transferencia Western (Western blot) consiste en transferir la proteína total de células o tejidos separados por electroforesis desde un gel a un sólido. Una tecnología de detección de proteínas que utiliza. anticuerpos específicos para detectar un antígeno específico en una membrana NC de soporte de fase o membrana de PVDF. El principio básico es teñir células o muestras de tejido biológico procesadas mediante electroforesis en gel a través de anticuerpos específicos. Los métodos experimentales se utilizan ampliamente y son métodos comunes de detección cualitativa y cuantitativa de proteínas. Para ideas experimentales, consulte la referencia [7].
Materiales experimentales
Células o tejidos frescos o congelados
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza la unión específica de antígenos y anticuerpos Métodos de detección cualitativa y cuantitativa de las respuestas inmunes.
Principio básico: unir el antígeno o anticuerpo a la superficie del portador en fase sólida y mantener su actividad inmune. El antígeno o anticuerpo se une a una enzima para formar un antígeno o anticuerpo marcado con enzima, que conserva tanto su actividad inmunológica como la actividad de la enzima. Durante la medición, la muestra a analizar y el antígeno o anticuerpo marcado con enzima reaccionan con el antígeno o anticuerpo en la superficie del soporte en fase sólida en diferentes pasos. El complejo antígeno-anticuerpo formado en el soporte de fase sólida se separa de otras sustancias mediante lavado. La cantidad de enzima finalmente unida al soporte de fase sólida es proporcional a la cantidad de sustancia problema en la muestra. Después de agregar el sustrato para la reacción enzimática, la enzima cataliza el sustrato en un producto coloreado. La cantidad del producto está directamente relacionada con la cantidad de sustancia de prueba en la muestra, por lo que se puede analizar cualitativa o cuantitativamente según. la profundidad de la reacción del color. Para ideas experimentales, consulte la referencia [8].
Materiales experimentales
Células o tejidos frescos o congelados
La inmunohistoquímica (IHC) también se llama inmunocitoquímica. Aplica los principios de inmunología e histoquímica para detectar niveles de proteínas en secciones de tejido. Utiliza anticuerpos (o antígenos) específicos marcados para detectar la distribución de antígenos (o anticuerpos) en tejidos in situ en tejidos y células, detecta los antígenos (o anticuerpos) diana correspondientes y realiza análisis de localización, cualitativos y cuantitativos. Según las propiedades de los marcadores, las tecnologías de detección se dividen en: tecnología de inmunofluorescencia, tecnología de inmunoenzimas, tecnología de inmunometales y radioinmunoensayo. La tecnología de inmunofluorescencia y la tecnología de inmunoenzimas se utilizan comúnmente en experimentos. Para ideas experimentales, consulte la referencia [9].
Materiales experimentales
Tejidos incluidos en parafina, muestras celulares y secciones de tejido congelado
3. Experimento de verificación de marcadores metabolómicos
¿Cromatografía de gases? -espectrometría de masas (GC-MS): la cromatografía de gases utiliza los diferentes coeficientes de distribución de diferentes sustancias en la fase estacionaria y la fase móvil para hacer que diferentes compuestos fluyan fuera de la columna cromatográfica en diferentes momentos para lograr el propósito de separar compuestos. La espectrometría de masas utiliza los patrones de movimiento de partículas cargadas en campos magnéticos o campos eléctricos para lograr la separación y el análisis en función de su relación masa-carga (m/z). Mide la masa de iones y la distribución de intensidad, y puede proporcionar el peso molecular. Composición elemental, fórmula molecular y estructura molecular del compuesto, con las características de especificidad cualitativa, sensibilidad, detección avanzada y velocidad rápida. Para ideas experimentales, consulte la referencia [10].
Materiales experimentales
Moléculas pequeñas, compuestos volátiles, térmicamente estables y vaporizables
Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS): Tiene una amplia gama de propiedades. rango de análisis, gran capacidad de separación, resultados de análisis cualitativos confiables, límite de detección bajo, tiempo de análisis rápido y alto grado de automatización. Utiliza cromatografía líquida como sistema de separación y espectrometría de masas como sistema de detección. La muestra se separa de la fase móvil en la parte del espectrómetro de masas. Después de ionizarse, el analizador de masas del espectrómetro de masas separa los fragmentos de iones según sus números de masa y se obtiene el espectro de masas a través del detector. Para ideas experimentales, consulte la referencia [11].
Materiales experimentales
Experimento de verificación de marcadores transcriptomas no volátiles, polarizados, térmicamente inestables y macromoléculas (proteínas, polipéptidos, polímeros, etc.)
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1. Verificación de expresión
qRT-PCR (ver Genómica) y Northern blot.
La hibridación por transferencia Northern (Northern blot) se utiliza para detectar si una muestra contiene el producto del transcrito (ARNm) de un gen y cuantificarlo. El principio es realizar una electroforesis en gel de agarosa en la muestra de ARN que se va a analizar en condiciones desnaturalizantes, luego transferir la posición en el gel a una membrana de nitrocelulosa o membrana de nailon y luego fijarla con un isótopo u otro ARN marcado con un marcador. . Hay pocos documentos de aplicación y se pueden encontrar ideas experimentales en la referencia [12].
Materiales experimentales
Muestras de ARN total o muestras de ARNm (el ARN se degrada fácilmente, por lo que se debe prestar atención al método y período de almacenamiento)
Sensibilidad: qRT -PCR>Northern blot, Especificidad: Northern blot>qRT-PCR (protocolo experimental explicado anteriormente).
2.? Interacción entre ARN y proteína
Inmunoprecipitación de ARN (RIP): La proteína de unión a ARN (RBP) de interés se inmunoprecipita y se identifica junto con el ARN al que se une. Se une al ARN transcrito.
Puede detectarse mediante RT-PCR, microarrays o secuenciación. Es una tecnología basada en anticuerpos que se utiliza para localizar las interacciones ARN-proteína en el cuerpo. Para ideas experimentales, consulte la referencia [13].
Materiales experimentales
Células
ARN-pull down: el ARN se marca (como el etiquetado de una sonda biológica) y luego se mezcla con una solución de extracción de proteínas citoplasmáticas** * Se incuban juntos para formar complejos de ARN-proteína, se separan las proteínas mediante SDS-PAGE y, finalmente, se detectan las proteínas mediante Western blot o espectrometría de masas. Se utiliza para encontrar proteínas que se unen al ARN diana. Para ideas experimentales, consulte la referencia [14].
Materiales experimentales
Proteínas citoplasmáticas celulares
Además, también incluye: inmunoprecipitación de ARN metilado (MeRIP) [13].
Eso es todo para compartir hoy. Dado que existen muchos métodos para verificar cada marcador ómico, este problema comparte principalmente soluciones comunes. Espero que todos tengan una comprensión simple de los métodos experimentales de cada marcador ómico. Cada investigación posterior sobre mecanismos relacionados con la ómica también debe incluir experimentos funcionales celulares como proliferación celular, migración celular, invasión, experimentos de apoptosis celular y modelos animales. Creo que después de leer, los métodos para explorar estos mecanismos son prácticamente los mismos. la literatura relevante, todos Pronto descubrirán el patrón ~
Finalmente, ¡deseo que todos ganen cada manuscrito de SCI!
Referencias
1.?Liu X, Wang J, Chen M, Liu S, Yu X, Wen F. Combinación de datos de las bases de datos TCGA y GEO y validación de PCR cuantitativa con transcripción inversa para identificar marcadores de pronóstico genético en el cáncer de pulmón Onco Targets Ther. de la presencia bacteriana en el tumor y el tejido normal adyacente en 9 tipos principales de cáncer mediante la secuenciación del exoma TCGA". Revista de biotecnología computacional y estructural vol. 18 631-641. 13 de marzo de 2020, doi:10.1016/j.csbj .2020.03.003
3. Zhou F, Liu X, Zuo D, et al. El lncRNA AK006025 inducido por VIH-1 Nef regula la expresión del gen del grupo CXCL9/10/11 en astrocitos mediante la interacción con CBP/P300.?J Neuroinflammation 2018. ;15(1):303. Publicado el 31 de octubre de 2018. doi:10.1186/s12974-018-1343-x
4.?Xie K, Zhang K, Kong J, et al. PIWIL1 promueve la proliferación, migración e invasión celular en el adenocarcinoma de pulmón.? Cancer Med.? , Zhou C, et al. La metilación aberrante del homólogo 1 de mutL se asocia con un mayor riesgo de cáncer de pulmón de células no pequeñas. J Clin Lab Anal 2018;32(5):e22370: 10.1002/jcla.22370. /p>
6. Pangeni, Rajendra P et al. “Los ge GALNT9, BNC1 y CCDC8
Los tumores de mama con frecuencia están desregulados epigenéticamente en tumores de mama que hacen metástasis en el cerebro."?Clinical epigenetics?vol. 7,1 57. 27 de mayo de 2015, doi:10.1186/s13148-015-0089-x
7 .?Han D, Yu T, Dong N, Wang B, Sun F, Jiang D. Napabucasin, un nuevo inhibidor de STAT3 suprime la proliferación, la invasión y la potencia de las células de glioblastoma.?J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1): 289. Publicado el 5 de julio de 2019. doi:10.1186/s13046-019-1289-6
8.?Wang D, Yuan W, Wang Y, et al. Suero CCL20 combinado con IL-17A como diagnóstico temprano. y biomarcadores de pronóstico para el cáncer colorrectal humano.?J Transl Med. 2019;17(1):253 Publicado el 6 de agosto de 2019. doi:10.1186/s12967-019-2008-y
9.?Liu L , Liu X, Dong Z, et al. Los objetivos genómicos relacionados con la N6-metiladenosina están alterados en el tejido del cáncer de mama y se asocian con una supervivencia deficiente. J Cancer 2019;10(22):5447-5459 Publicado el 29 de agosto de 2019. :10.7150/jca.35053
10. Chen H, Pan D, Yang Z, Li L. El análisis integrado y la eliminación de RAB23 indican el papel de RAB23 en el adenocarcinoma gástrico. Ann Transl Med. 2019;7(23):745. doi:10.21037/atm.2019.11.130
11.?Apaya MK, Shiau JY, Liao GS, et al. Los análisis de vías integradas basadas en ómicas descubren el CYP. Redes asociadas a epoxigenasa como objetivos teranósticos para el cáncer de mama triple negativo metastásico. J Exp Clin Cancer Res 2019;38(1):187 Publicado el 9 de mayo de 2019. doi:10.1186/s13046-019-1187-y
.12. Wang XL, Shi WP, Shi HC, et al. La eliminación de TRIM65 inhibe la proliferación y migración de células de cáncer de pulmón.
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15. ?Métodos de verificación experimentales después de la secuenciación de alto rendimiento: Transcriptoma (Parte 1)