Determinación de la actividad enzimática relacionada con el ácido ascórbico

Experimento 4: Determinación del contenido de ácido ascórbico y actividad peroxidasa del ácido ascórbico

1. Determinación del contenido de ácido ascórbico

Principio

Reducido El ácido ascórbico (AsA) puede reducir los iones de hierro a iones ferrosos, que reaccionan con la bifenantrolina (4,7-difenil-1,10-fenantrolina, BP) para formar un quelato rojo. El valor de absorción a la longitud de onda de 534 nM está relacionado positivamente con el contenido de AsA, por lo que puede medirse mediante colorimetría. El ácido desoxiascórbico (DAsA) se puede reducir a AsA mediante ditiotreitol (DTT). Determine la cantidad total de AsA y reste el AsA reducido para obtener el contenido de DAsA.

Instrumentos y Utensilios

Centrífuga; espectrofotómetro;

Reactivos

Ácido tricloroacético (TCA) al 5%

TCA al 20%

Solución de etanol absoluto

Solución de etanol BP al 0?5%;

Solución de etanol FeCl3 al 0?03%;

0,6 g/l de DTT;

Solución de NA2HPO4-NAOH: mezcle cantidades iguales de 0,2 mol/l de NA2HPO4 y 1,2 mol/l de NAOH;

60 mmol/l de DTT: etanol.

Método

1. Haga una curva estándar y prepare las concentraciones como 2 mg/L, 4 mg/L, 6 mg/L, 8 mg/L, 10 mg/L, 12 mg/L, Solución estándar serie AsA de 14Mg/L. Tome 1,0 ml de cada solución estándar de concentración en un tubo de ensayo, agregue 1,0 ml de TCA al 5 % y 1,0 ml de etanol, agite bien y luego agregue 0,5 ml de etanol H3PO4 al 0,4 % y 1,0 ml de etanol BP al 0,5 % en secuencia, 0? 5 ml de etanol FeCl3 al 0,03 %, volumen total 5 ml. La solución se dejó reaccionar a 30°C durante 90 minutos y luego se midió A534. Dibuje una curva estándar con la concentración de AsA como abscisa y A534 como ordenada, y obtenga la ecuación lineal.

2. Extraer 1?0g de hojas de plantas, triturar con 5% de TCA a 1:5 (W/V), centrifugar a 4000 r/min durante 10 min y utilizar el sobrenadante para medir.

3. Determinación

(1) Determinación de AsA: Tome 1,0 ml de solución de extracto de muestra en un tubo de ensayo, mídala según el mismo método anterior y calcule el contenido de AsA de acuerdo. a la curva estándar.

(2) Medición de DAsA: agregue 0,5 ml de solución de DTT-etanol de 60 mmol/l a 1,0 ml de solución de muestra, use una solución mixta de NA2HPO4-NAOH, ajuste el pH de la solución a 7 ~ 8 y colóquela a temperatura ambiente durante 10 minutos para restaurar DAsA. Luego agregue 0,5 ml de TCA al 20 % y ajuste el pH a 1 ~ 2. Mida el mismo método que AsA, calcule el contenido total de AsA y reste AsA para obtener el contenido de DAsA.

2. Actividad de la peroxidasa del ácido ascórbico (AsA-POD)

Principio

AsA-POD cataliza la reacción entre AsA y H2O2, oxidando AsA en ácido hidroascórbico monodetasa. (MDAsA). A medida que se oxida AsA, el valor de extinción (A290) a una longitud de onda de 290 nM en la solución disminuye. En función de la disminución de A290 por unidad de tiempo, se calcula la actividad de AsA-POD. La cantidad de AsA oxidado se calcula basándose en el coeficiente de extinción de 2,8 (MMol/L)/CM. La actividad enzimática se puede expresar por el número de micromoles de AsA oxidados por gramo de peso fresco por hora, μMol/g·H.

Instrumentos

Centrífuga; espectrofotómetro UV;

Reactivos

Tampón K2PO4-KH2PO4 de 50MMol/L (PH7?0, que contiene 0?1MMol/L de EDTA-NA2)?

0?3MMol/L AsA;

20μMol/L AsA;

0?06MMol/L H2O2.

Método

1. Preparación de la solución enzimática: corte 1,0 g de hojas de plantas en trozos y agregue tampón K2HPO4-KH2PO4 de 50 mmol/l preenfriado en una proporción de 1:3 ( P/V) Triturar y extraer, filtrar con dos capas de gasa, centrifugar el filtrado a 4000 r/min durante 10 minutos y utilizar el sobrenadante como extracto enzimático crudo para la medición.

2. Medición de la actividad enzimática: la mezcla de reacción de 3 ml contiene 50 mmol/l de tampón K2HPO4-KH2PO4 (PH7?0), 0,1 mmol/l de EDTA-NA2, 0,3 mmol/l de AsA, 0,06 mmol/l de H2O2. y 0,1 ml de solución enzimática. Inmediatamente después de agregar H2O2, mida el cambio en A290 dentro de 10 a 30 segundos a 20 °C y calcule la reducción de AsA y la actividad enzimática por unidad de tiempo.

Preguntas para pensar

1. ¿Cuál es el significado fisiológico del ácido ascórbico en las plantas?

2.