Procedimientos operativos básicos para experimentos de biología molecular

Capítulo 3 Técnicas básicas de operación experimental de biología molecular

Las técnicas básicas de operación experimental aquí se refieren a los experimentos más utilizados, más utilizados y casi todos en los experimentos de biología molecular. Se deben aplicar tecnologías. La limpieza de utensilios, el correcto funcionamiento y uso de instrumentos de medición como tubos de ensayo, probetas (vasos), matraces aforados, pipetas y pipetas, balanzas electrónicas y preparación de reactivos deben ser técnicas operativas básicas, pero estos contenidos se han utilizado. En química analítica, la bioquímica se trata en detalle en cursos de laboratorio. Este capítulo presenta principalmente la tecnología de esterilización, la tecnología de operación aséptica y la tecnología de microoperación relacionadas con experimentos de biología molecular.

3.1 Tecnología de esterilización (esterilización)

En el proceso de realización de experimentos de biología molecular, se requiere un entorno experimental limpio y los utensilios y soluciones utilizados deben desinfectarse (esterilizarse). El tratamiento bacteriano, por un lado, evita la contaminación de microorganismos en el medio ambiente y, por otro lado, también puede eliminar la interferencia y la influencia de proteasas y nucleasas en los experimentos. Los requisitos para un cultivo puro de microorganismos y células son mayores y no debe haber bacterias extrañas. Por lo tanto, todos los equipos y medios de cultivo deben esterilizarse estrictamente y desinfectarse el lugar de trabajo para garantizar el buen desarrollo del trabajo.

Existen dos métodos principales de esterilización comúnmente utilizados en los laboratorios: los métodos físicos y los métodos químicos. Los métodos físicos incluyen el uso de calor húmedo (vapor a alta presión), calor seco, rayos ultravioleta, filtración, precipitación centrífuga y otros métodos para eliminar microorganismos. Los métodos químicos utilizan desinfectantes químicos, antibióticos, etc. para matar o inhibir los microorganismos. Dependiendo de las propiedades del material y los requisitos experimentales de los artículos a esterilizar, se pueden adoptar diferentes métodos de desinfección y esterilización.

3.1.1 Método de esterilización física

(1) Esterilización por calor seco: La esterilización por calor seco incluye la esterilización por llama y la esterilización por aire caliente.

La combustión con llama es adecuada para esterilizar utensilios metálicos, como asas de inoculación, agujas de inoculación e instrumentos quirúrgicos, y los cuellos de cristalería, como bocas de tubos de ensayo y de botellas, varillas de vidrio, etc. Este método esteriliza rápida y completamente.

La esterilización con aire caliente generalmente se realiza en un horno, utilizando aire seco a alta temperatura (160 °C a 170 °C) para calentar y esterilizar durante 1 a 2 horas, y es adecuada para cristalería, placas de Petri. , etc. Los utensilios después de la esterilización con calor seco quedan secos y fáciles de almacenar. La desventaja es que la conducción del calor seco es lenta y puede quedar aire frío en el horno, por lo que se requiere una temperatura más alta y un tiempo más largo para lograr el propósito de desinfección. Cabe señalar que la puerta del horno no debe abrirse inmediatamente después de la esterilización por horneado en seco. La puerta del horno debe abrirse cuando la temperatura descienda por debajo de 70 °C para evitar que entre aire frío repentinamente, lo que afectará el efecto de esterilización, dañará la cristalería o provocará accidentes. . Durante la esterilización, los artículos no deben colocarse demasiado apretados. No debe haber agua en la cristalería esterilizada. La cristalería que contenga agua es fácil de explotar durante la esterilización con calor seco. Los medios de cultivo, los productos de caucho y los productos de plástico no se pueden esterilizar con este método.

(2) Esterilización por calor húmedo: a la misma temperatura, el efecto de esterilización del calor húmedo es mejor que el de la esterilización por calor seco. Las razones son: (1) El vapor caliente tiene un efecto destructivo más fuerte sobre los componentes de la celda. La presencia de moléculas de agua ayuda a destruir los enlaces de hidrógeno y otros enlaces interactivos débiles que mantienen la estructura tridimensional de la proteína, lo que facilita la desnaturalización de la proteína. El calentamiento desnaturaliza las proteínas, lo que está relacionado con el contenido de agua. Cuanto mayor es el contenido de agua del medio ambiente y de las células, más rápida es la solidificación. El contenido de agua de la proteína es inversamente proporcional a su temperatura de solidificación; (2) el vapor caliente tiene un poder de penetración más fuerte que el aire caliente y puede matar microorganismos de manera más efectiva (3) el vapor tiene potencial y puede liberar una gran cantidad de energía térmica cuando el gas; se convierte en líquido, por lo que puede aumentar la temperatura de los objetos esterilizados más rápidamente.

Los métodos comúnmente utilizados de esterilización por calor húmedo incluyen la esterilización con vapor a alta presión, la esterilización con vapor a presión atmosférica y la esterilización por ebullición. Entre ellos, la esterilización con vapor a alta presión es la más utilizada y la que tiene el mejor efecto. La esterilización con vapor a presión normal no puede matar las esporas bacterianas en poco tiempo y se debe utilizar esterilización intermitente o esterilización continua para lograr una esterilización completa. La esterilización por ebullición solo se utiliza para esterilizar jeringas y ciertos utensilios, y la humedad de los artículos a esterilizar es demasiado alta. Por lo tanto, estos dos métodos rara vez se utilizan.

La esterilización con vapor de alta presión se realiza en una olla de vapor de alta presión cerrada. El principio es: colocar los objetos a esterilizar en una olla de esterilización por vapor a alta presión llena con una cantidad adecuada de agua, calentar el agua en la olla hasta que hierva y eliminar por completo el aire frío original en la olla, luego sellar la Olla y continuar calentando aumentará gradualmente la presión del vapor en la olla, haciendo que la temperatura suba por encima de 100°C.

Al esterilizar, elija diferentes presiones y tiempos según los diferentes artículos. El requisito para la esterilización de artículos generales (como paños, instrumentos metálicos, cristalería, etc.) es de 0,15 MPa durante 15 minutos, y el requisito. para fluidos de cultivo y productos de caucho es de 10 minutos a 0,1 MPa. Agregue una cantidad adecuada de agua a la olla antes de la esterilización. Agregar muy poca agua puede secar fácilmente la olla de esterilización y provocar una explosión. Agregar demasiada agua puede hacer que los artículos esterilizados se empapen en agua. Los artículos no se pueden llenar en exceso para evitar afectar la circulación del gas en el esterilizador. El tubo guía de aire debe extenderse hasta el fondo del tanque para evitar obstrucciones. Antes de calentar y aumentar la presión, abra la válvula de escape para descargar el aire frío en el esterilizador. Después de descargar el aire frío, cierre la válvula de escape y verifique que la válvula de seguridad se mueva libremente. Comience a aumentar la presión. alcanzado, inicie el temporizador y controle la presión constante. Durante el proceso de esterilización, el operador no puede abandonar el lugar de trabajo y debe comprobar periódicamente la presión y la seguridad para evitar accidentes. Una vez completada la esterilización, asegúrese de abrir la válvula para liberar el aire. Cuando la presión en el recipiente de esterilización baje a "0", abra la tapa del recipiente de esterilización. También puede cerrar la válvula de alimentación principal después de completar la esterilización y permitir que los artículos esterilizados se enfríen naturalmente. Cuando el manómetro del recipiente de esterilización baje a "0", saque los artículos esterilizados.

La relación entre la presión del vapor y la temperatura

Presión del vapor (presión manométrica) Temperatura del vapor

Kg/cm2 MPa ℃ ℉

0.00 0,00 100 212

0,25 0,025 107,0 224

0,50 0,050 112,0 234

0,75 0,075 115,5 240

1,00 0,100 121,0 250

1,50 0,150 128,0 262

2,00 0,200 134,5 274

(3) Esterilización ultravioleta: el rango de longitud de onda de la luz ultravioleta es de 200 ~ 300 nm y el rango de esterilización es de 240 ~ 280 nm, donde la longitud de onda está entre los rayos ultravioleta, alrededor de 260 nm, tienen el efecto esterilizante más fuerte. La lámpara ultravioleta es una lámpara artificial de mercurio de baja presión que puede irradiar luz ultravioleta de 257,3 nm. Tiene una gran capacidad de esterilización y es relativamente estable. El efecto bactericida de la luz ultravioleta es que puede ser absorbida por proteínas (longitud de onda 280 nm) y ácidos nucleicos (longitud de onda 260 nm), provocando la desnaturalización e inactivación de estas moléculas. La luz ultravioleta tiene poca capacidad de penetración y no puede penetrar el vidrio, la ropa, el papel y la mayoría de los demás objetos, pero puede penetrar el aire. Se utiliza principalmente en el aire del laboratorio, las superficies de las mesas de operaciones y los artículos que no se pueden esterilizar con otros métodos. La irradiación directa de rayos ultravioleta es conveniente y eficaz. Después de un cierto período de irradiación, se puede eliminar la mayoría de las bacterias del aire. La lámpara ultravioleta en la sala de cultivo no debe estar a más de 2,5 metros del suelo y los elementos de desinfección no deben bloquearse entre sí. Los lugares que no se pueden iluminar no podrán desinfectarse.

La irradiación ultravioleta puede producir ozono, contaminar el aire, tener efectos adversos sobre los reactivos y los fluidos de cultivo y también puede ser perjudicial para la piel humana.

(4) Esterilización por filtración: muchos líquidos no se pueden esterilizar mediante esterilización a alta presión, como suero, fluido de cultivo sintético, enzimas y líquidos que contienen proteínas biológicamente activas, etc. Se pueden utilizar métodos de filtración para eliminar microorganismos como como bacterias. Hay dos tipos de filtros: tipo de succión (filtración por succión) y tipo presurizado; la estructura de la placa del filtro (o membrana del filtro) se puede dividir en placa de asbesto, vidrio o membrana microporosa. Los filtros más utilizados incluyen filtros Zeiss, filtros de vidrio y filtros de membrana microporosa, entre los cuales los filtros de membrana microporosa son los más utilizados.

Los filtros de membrana microporosa son en su mayoría estructuras de plástico y se dividen en partes superior e inferior, con una membrana filtrante de celulosa colocada en el medio. Inhale el líquido a filtrar en la jeringa, inyéctelo lentamente en el orificio de la parte superior del filtro y páselo a través de la membrana del filtro en el medio. Puede usarse para la filtración y esterilización de diversos fluidos de cultivo, incluido el suero, con alta velocidad y buen efecto. La membrana de filtro es una membrana de filtro de celulosa mixta especial desechable con tres tamaños de poro: 0,6 μm, 0,45 μm y 0,22 μm. Cuando se usa para filtración y esterilización, es mejor usar una membrana de filtro de 0,22 μm (que puede eliminar bacterias y moho). ). Preste atención al instalar la membrana del filtro: sumerja la membrana del filtro en agua destilada antes de instalarla. La membrana del filtro es delgada, suave y fácil de mover, y no debe instalarse desalineada para causar fallas en la filtración; preste atención; la parte delantera y trasera de la membrana del filtro, el lado frontal (luz) debe estar hacia arriba. Debido a que la membrana del filtro es delgada y puede soportar una presión limitada, la presión no debe ser demasiado alta ni demasiado fuerte para evitar la ruptura de la membrana del filtro. Después de cada filtración, se debe abrir el filtro para verificar si la membrana del filtro se ha movido o roto para garantizar una filtración y esterilización efectivas.

El método de limpieza y desinfección del filtro de membrana microporosa es muy sencillo. Después de su uso, retire la membrana del filtro, enjuáguela con agua desionizada y luego coloque la nueva membrana del filtro correctamente. Después de envolverla, se puede esterilizar mediante alta presión o. Hervido directamente. Proceso de esterilización. Ahora también existen pequeños filtros desechables.

3.1.2 Método de esterilización química

Utilizar agentes químicos para destruir las funciones metabólicas bacterianas. Los fungicidas químicos de uso común incluyen: etanol, ácido acético, formalina, permanganato de potasio, clormetionina, etc. Los más comunes son el alcohol al 75% y el 1‰ de cloruro de benzalconio. El primero se utiliza principalmente para el tratamiento de la piel del operador, la superficie de la mesa de operaciones y las paredes de la sala estéril. Este último se utiliza principalmente para remojar instrumentos y limpiar y desinfectar la piel y las paredes del quirófano. El método de esterilización química es simple, conveniente y eficaz.

La mezcla de permanganato de potasio en polvo con un volumen adecuado de formalina producirá una gran cantidad de gas formaldehído, que a menudo se utiliza para fumigación y desinfección en salas estériles.

3.1.3 Método de esterilización con antibióticos

Se utiliza principalmente para esterilizar fluidos de cultivo o prevenir la contaminación del cultivo. Cabe señalar que no se puede confiar exclusivamente en los antibióticos para lograr el propósito de desinfección y esterilización, y se deben seguir estrictamente procedimientos asépticos. Los antibióticos más utilizados son la penicilina y la estreptomicina.

3.2 Tecnología de operación aséptica

La tecnología aséptica se refiere a la tecnología de operación y el manejo que evita que todos los microorganismos invadan el cuerpo y evita que los artículos y áreas estériles se contaminen durante el método del experimento. Es una operación básica importante para prevenir y controlar la contaminación cruzada durante el proceso experimental. Las técnicas de operación aséptica a menudo están involucradas en experimentos bioquímicos, especialmente el cultivo puro de microorganismos, células y embriones, que requieren técnicas de operación asépticas estrictas. Durante el proceso de operación aséptica, cualquier enlace no debe violar los principios operativos, de lo contrario el experimento podría fallar. Por lo tanto, es necesario fortalecer el concepto de asepsia, dominar con precisión y habilidad las técnicas asépticas y cumplir estrictamente con los procedimientos operativos asépticos.

La tecnología aséptica incluye cuatro partes: el tratamiento de vidrio, productos plásticos e instrumentos metálicos utilizados en experimentos; el tratamiento estéril de los objetos y reactivos operativos experimentales; el tratamiento del entorno de trabajo y las técnicas operativas del experimentador; . Las dos primeras partes se presentaron anteriormente y las dos últimas se presentan principalmente aquí.

1. Planificación cuidadosa: haga un plan experimental y procedimientos operativos antes de comenzar el experimento. Los cálculos relacionados con los datos deben realizarse con antelación.

2． Prepárese cuidadosamente de acuerdo con los requisitos experimentales, prepare varios equipos y elementos necesarios y elija los métodos adecuados para el embalaje y la esterilización. Una vez que el inventario sea correcto, colóquelos en el lugar de operación (sala de cultivo, banco de trabajo ultralimpio). Esto puede evitar aumentar las posibilidades de contaminación debido a una recuperación incompleta de los elementos después de comenzar el experimento.

3. Operación estricta

Antes del experimento, la sala estéril y la mesa de trabajo ultralimpia se esterilizaron con luz ultravioleta durante 30 a 60 minutos, la mesa de operaciones esterilizada se limpió con alcohol al 70 % y el ventilador de la mesa de operaciones esterilizado se encendió. Encendido durante 10 minutos. Finalmente, inicie la operación experimental. Las operaciones experimentales deben realizarse en la zona central estéril del banco de trabajo limpio y no en las zonas no estériles del borde.

Para facilitar el acceso, los suministros sobre la superficie de trabajo deben estar razonablemente dispuestos. En principio, los artículos para la mano derecha deben colocarse en el lado derecho, los suministros para la mano izquierda deben estar en el lado izquierdo. La lámpara de alcohol debe colocarse en el centro.

Cuando se trabaja en un banco limpio, dado que es necesario extender todo el antebrazo dentro de la caja, se debe usar un mono limpio de manga larga y se deben limpiar las manos con alcohol al 75% o lavar con desinfectante antes de comenzar. operaciones. Si sus manos tocan elementos potencialmente contaminados durante el experimento y al entrar o salir de la sala de cultivo, debe lavarse las manos nuevamente con desinfectante. Al ingresar a la sala de cultivo celular, debe lavarse bien las manos, usar mascarilla y usar ropa, gorros y zapatos esterilizados.

Al cultivar o realizar otros trabajos estériles en un ambiente estéril, primero encienda una lámpara de alcohol o de gas. Todas las operaciones futuras, como instalar tapones para pajitas, abrir o cerrar bocas de botellas, etc., deben realizarse cerca de la llama y después de la cauterización. Pero tenga cuidado: los instrumentos metálicos no se pueden quemar en la llama durante demasiado tiempo para evitar el recocido. Las pinzas de metal quemadas deben enfriarse antes de que puedan recoger el tejido para evitar dañarlo. La pajita después de absorber la solución nutritiva no se puede quemar con una llama, porque la solución nutritiva que queda en el cabezal de la pajita puede carbonizarse y formar una película de carbón, que traerá sustancias nocivas a la solución nutritiva cuando se reutilice. Al abrir y cerrar frascos de cultivo que contienen células o microorganismos, el tiempo de esterilización por llama debe ser corto para evitar que las células o microorganismos mueran quemados debido a una temperatura excesiva. Además, el tapón de goma no debe pasarse por la llama durante mucho tiempo para evitar quemarse y producir gases tóxicos, que pueden dañar las células cultivadas. Al realizar operaciones asépticas, los movimientos deben ser precisos y ágiles, pero no demasiado rápidos para evitar el flujo de aire y aumentar las posibilidades de contaminación.

No toque los utensilios esterilizados con las manos. Si los ha tocado, esterilícelos con llama o sustitúyalos por otros de repuesto.

Se debe mantener una determinada secuencia de trabajo de principio a fin. Los tejidos o células no deben exponerse al aire prematuramente antes de su procesamiento. De manera similar, no abra los frascos de líquidos de cultivo y otras soluciones prematuramente antes de usarlos; cuando abra la tapa del frasco para la operación, mantenga la boca del frasco hacia arriba en un ángulo de 45 grados con respecto a la mesa para reducir la posibilidad de colonización bacteriana; No reutilizarlo después de su uso. La boca del frasco debe cerrarse inmediatamente. Al absorber solución nutritiva, tampón PBS, suspensión celular y otros líquidos diversos, las pipetas se deben usar por separado y no se pueden mezclar para evitar afectar el efecto de los reactivos, expandir la contaminación o causar contaminación cruzada de las células. No hable ni tosa mirando hacia la superficie de trabajo durante el trabajo para evitar que la saliva introduzca bacterias o micoplasmas en la superficie de trabajo y cause contaminación. Las manos u objetos relativamente sucios no pueden pasar por la boca de la botella abierta. La boca de la botella es la más susceptible a la contaminación. Si la punta de la pajita toca la boca de la botella al agregar líquido, la pajita debe reemplazarse por una limpia.

Para microorganismos o células, solo se debe procesar un tipo de microorganismo o una cepa celular en cada operación. Incluso si el medio de cultivo es el mismo, no compartir el medio de cultivo para evitar contaminación entre microorganismos o células. .

4. Una vez completado el experimento, los elementos experimentales y el líquido residual se deben sacar del banco de trabajo a tiempo, se debe apagar el ventilador, se debe limpiar la superficie de operación esterilizada con alcohol al 70% y el ventilador y la iluminación del ultra- El banco de trabajo limpio debe estar apagado. El experimento está completo. Aunque la superficie de trabajo se desinfectará antes de cada experimento, se recomienda encender la lámpara UV para desinfectar inmediatamente después del experimento, especialmente en verano, para evitar el crecimiento de bacterias o moho.

El área de trabajo de operación aséptica debe mantenerse limpia y espaciosa. Los elementos necesarios, como soportes para tubos de ensayo, extractores de pajitas o cajas de pajitas, se pueden colocar temporalmente. Otros suministros experimentales deben retirarse tan pronto como se utilicen. hacia arriba para facilitar la circulación del aire.

3.3 Tecnología de operación de microvolumen

En experimentos anteriores, las unidades de medida de peso y volumen utilizadas fueron principalmente gramos (g) y mililitros (ml) y superiores, y menos de Las unidades Las cantidades de g y ml, como miligramos (mg), microgramos (?g) y microlitros (?l), rara vez se utilizan. Desde el comienzo de los experimentos de biología molecular, estas unidades de medida muy pequeñas se utilizarán con frecuencia, y también se utilizarán unidades aún más pequeñas como nanogramos (ng), picogramos (pg) y nanolitros (nl). La transición repentina de operaciones relativamente macroscópicas a operaciones microscópicas requiere un proceso familiar y competente para los principiantes. La clave es prestar atención a los siguientes aspectos.

1. Conocer y dominar el uso correcto de los equipos de micropesaje. Las microbalanzas electrónicas (sensibilidad mínima de 10 a 4 g) y las micropipetas (máximo de 2 l) son los dos instrumentos más utilizados. Consulte el Capítulo 2 para conocer su uso. La medición precisa es el primer y más importante paso en la operación de microvolúmenes.

2. Mide con precisión una o varias sustancias líquidas y agrégalas al mismo tubo Eppendorf. Debes asegurarte de que cada líquido se agregue en él, y al sacar la pipeta, la punta de la punta no debe sacar ninguna gota de líquido visible.

3. Mezclar y concentrar. Una vez añadido todo el líquido, el volumen total es de sólo 10 a decenas de microlitros, lo que dificulta mezclar bien los distintos ingredientes utilizando métodos de mezcla convencionales. Los métodos de micromezcla incluyen: mezcla con vórtice y mezcla. Tape firmemente el tubo Eppendorf que contiene el líquido, sosténgalo firmemente y haga contacto con el fondo con el agitador vórtex. El líquido girará a alta velocidad en el tubo y se mezclará. También puede sostener el extremo superior (boca) del tubo Eppendorf tapado. Con la otra mano, mueva el fondo repetidamente para mezclar el líquido del interior. Finalmente, use una centrífuga de mesa de alta velocidad para hacer girar todo el líquido hasta el fondo del tubo Eppendorf.

4. A veces se disuelven cantidades muy pequeñas de sustancias como fragmentos de ADN o ADN plasmídico en unos pocos microlitros de líquido. Aunque la sustancia a disolver no es visible, una vez añadido el líquido se utiliza el mismo método. como se usa arriba. También se disuelve bien y se mezcla bien.

5. Debido a la operación de microvolumen, los resultados experimentales son difíciles de observar directamente a simple vista. Para garantizar el progreso fluido del experimento, en el proceso de experimentos de biología molecular, los resultados de cada paso del experimento deben mostrarse utilizando métodos de detección e identificación relevantes, y la siguiente reacción se puede llevar a cabo solo después de que se haya realizado el juicio. correcto. Este es un requisito común para todos los experimentos científicos, pero se debe enfatizar y prestar más atención en los experimentos de biología molecular.

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