¿Cómo determinar el contenido de proteínas mediante el método Kjeldahl?
(1) Digestión
1. Preparar 6 matraces Kjeldahl y etiquetarlos. Agregue 1,0 ml de solución proteica de concentración adecuada a los matraces 1, 2 y 3 respectivamente. La muestra debe agregarse al fondo del matraz y no se pegue a la boca ni al cuello de la botella. Luego agregue 0,3 g de agente de contacto sulfato de potasio y sulfato de cobre, 2,0 ml de ácido sulfúrico concentrado y 1,0 ml de peróxido de hidrógeno al 30 % en secuencia. Los matraces nº 4, 5 y 6 se utilizan como controles en blanco para medir trazas de sustancias que contienen nitrógeno que pueden estar contenidas en los reactivos y para calibrar las mediciones de las muestras. Agregue 1,0 ml de agua destilada a los matraces N° 4, 5 y 6 para reemplazar la solución de muestra, y los reactivos restantes agregados son los mismos que los de los matraces N° 1, 2 y 3. 2. Coloque cada matraz con reactivos agregados en la rejilla de digestión y conecte el dispositivo de extracción de aire. Primero calentar y hervir a fuego lento. En este momento, el contenido del matraz se carbonizará y se volverá negro, y se producirá una gran cantidad de espuma. Asegúrese de evitar que las burbujas salgan corriendo de la boca del tubo. . Después de que la espuma desaparezca y deje de producirse, aumente la potencia del fuego y mantenga el líquido en la botella a punto de ebullición. Después de que la solución esté clara, continúe calentando el jugo digestivo hasta que hierva ligeramente durante 15 minutos. Durante el proceso de digestión, el matraz debe girarse en cualquier momento para que todas las sustancias adheridas a la pared interior puedan fluir hacia el fondo para garantizar la digestión completa de la muestra. El gas liberado durante la digestión contiene SO2, que es muy irritante, por lo que se debe encender la bomba de agua de principio a fin para bombear el gas al agua del grifo y descargarlo. Todo el proceso de digestión debe realizarse en una campana extractora. Una vez completada la digestión, apague el fuego y deje que el matraz se enfríe a temperatura ambiente.
(2) Destilación y absorción
La destilación y la absorción se realizan en un microanalizador de nitrógeno Kjeldahl. Existen muchos tipos de dispositivos de destilación de nitrógeno Kjeldahl, que generalmente se componen de tres partes: generación de vapor, destilación de amoníaco y absorción de amoníaco. 1. Limpieza del instrumento Antes de instalar el instrumento, todas las piezas deben limpiarse mediante métodos generales. Los tubos y tapones de goma utilizados deben sumergirse en una solución de NaOH al 10%, hervirse durante unos 10 minutos, lavarse y hervirse durante 10 minutos. Lavado varias veces y luego instalado e instalado. Fijado sobre un soporte de hierro. Antes de usar el instrumento, todas las tuberías de seguimiento deben lavarse con vapor para eliminar cualquier amoníaco que pueda quedar en las tuberías. El instrumento en uso debe lavarse con vapor durante 5 minutos antes de cada medición de muestra. Para instrumentos que no se han utilizado durante mucho tiempo, repita la limpieza con vapor al menos tres veces y compruebe si el instrumento está normal. Verifique todas las conexiones cuidadosamente para asegurarse de que no haya fugas de aire. Primero, agregue aproximadamente 2/3 del volumen de agua destilada al generador de vapor, agregue unas gotas de ácido sulfúrico para mantenerla ácida y evitar que el amoníaco del agua se evapore y afecte los resultados, y ponga un poco de zeolita (o capilar, etc.) para evitar golpes. Agregue aproximadamente 20 ml de agua destilada a lo largo de la pared del vaso de vidrio pequeño y deje que el agua fluya hacia la cámara de reacción a través de la cánula. Sin embargo, el agua en el vaso de vidrio no debe dejar salir la luz. Conecte un tapón de vidrio en forma de varilla. para mantener el sello de agua y evitar fugas de aire. Después de que se produzca vapor, cierre inmediatamente el interruptor en la tubería de descarga de líquido residual para que el vapor solo pueda ingresar a la cámara de reacción, lo que hace que el agua en la cámara de reacción hierva rápidamente. El vapor se evapora desde el puerto superior de la cámara de reacción a través del nitrógeno. -bola de fijación y entra al tubo del condensador para su enfriamiento. Se coloca en el extremo inferior un matraz Erlenmeyer para recibir el agua condensada. Comience a cronometrar desde que la bola fijadora de nitrógeno se calienta, continúe cocinando durante 5 minutos y luego retire la lámpara de gas. Después del lavado, sujete el tubo de goma de conexión entre el generador de vapor y el colector a medida que disminuye la presión de enfriamiento del gas, el líquido residual en la cámara de reacción se bombea automáticamente a la carcasa de la cámara de reacción. Abra la abrazadera de salida de descarga del líquido residual para liberar los residuos. líquido. Limpie así 2 a 3 veces, luego coloque un matraz Erlenmeyer que contenga una mezcla de ácido bórico e indicador debajo del tubo del condensador de modo que la boca inferior del tubo del condensador quede completamente sumergida en la solución, destile durante 1 a 2 minutos y observe la solución. en el matraz Erlenmeyer si cambia de color. Si no cambia de color, significa que se ha limpiado el interior del dispositivo de destilación. Retire el matraz Erlenmeyer, destile nuevamente durante 1 a 2 minutos, enjuague el puerto inferior del condensador con agua destilada, apague la lámpara de gas y el instrumento estará listo para analizar muestras. 2. Absorción por destilación de muestras estándar de nitrógeno inorgánico Debido a la engorrosa operación de determinación de nitrógeno, para familiarizarse con las técnicas operativas de destilación y titulación, los principiantes deben practicar repetidamente con muestras estándar de nitrógeno inorgánico antes de medir muestras de nitrógeno orgánico desconocido. El sulfato de amonio estándar de concentración conocida, comúnmente utilizado, se prueba tres veces. Tome cinco matraces Erlenmeyer limpios de 100 ml, agregue 20 ml de solución de ácido bórico al 2 % y de 3 a 4 gotas de indicador mixto azul de metileno y rojo de metilo (rojo púrpura) en secuencia. Tape las botellas y reserve. Tome uno de los matraces Erlenmeyer y conéctelo al extremo inferior del tubo del condensador, de modo que la salida del tubo del condensador quede sumergida en la solución. Nota: El pistón colector debe abrirse antes de esta operación para evitar que el líquido del matraz Erlenmeyer sea succionado. Agregue con precisión 2 ml de solución estándar de sulfato de amonio al vaso, levante con cuidado el tapón de vidrio en forma de varilla para que la solución de sulfato de amonio fluya lentamente hacia la botella de destilación, enjuague el vaso pequeño de vidrio 3 veces con una pequeña cantidad de agua destilada y Póngalo en la botella de destilación juntos.
Luego use una probeta medidora para agregar 10 ml de solución de NaOH al 30% en el vaso pequeño de vidrio, de modo que la solución alcalina fluya lentamente hacia la botella de destilación. Cuando la solución alcalina no haya fluido completamente, cubra herméticamente el tapón de vidrio en forma de varilla. . Agregue aproximadamente 5 ml de agua destilada al vaso pequeño y luego abra lentamente el tapón de vidrio, permitiendo que la mitad del agua fluya hacia la botella de destilación y la otra mitad permanezca en el vaso pequeño como sello de agua. Cerrar el pistón colector, calentar el generador de vapor y proceder con la destilación. La mezcla de indicador de ácido bórico en el matraz Erlenmeyer cambió de púrpura a verde debido a la absorción de amoníaco. Desde el momento de la decoloración, destilar durante otros 3 a 5 minutos. Mueva el matraz cónico de modo que el nivel del líquido en la botella esté aproximadamente a 1 cm de la abertura inferior del tubo de condensación. Enjuague la abertura inferior del tubo de condensación. pequeña cantidad de agua destilada. Continuar destilando durante 1 minuto. Retirar el matraz cónico y taparlo, listo para la titulación. Una vez completada la destilación primaria, retire la lámpara de gas, sujete el tubo de goma entre el generador de vapor y el colector, retire el líquido residual después de la reacción, enjuague el vaso pequeño con agua varias veces y retire el líquido residual. Después de varios enjuagues, se puede destilar la siguiente muestra. Haga esto dos veces más con sulfato de amonio estándar. Tome otros 2 ml de agua destilada en lugar del sulfato de amonio estándar para una segunda medición en blanco. Valorar juntos los matraces Erlenmeyer de cada destilación. 3. Absorción por destilación de muestras y blancos desconocidos: tomar tres muestras de proteínas digeridas y tres soluciones de control en blanco y realizar la destilación y absorción en secuencia. Agregue 5 ml de agua destilada caliente a la muestra digerida o la solución de control en blanco, agréguela a la cámara de reacción a través de un vaso de vidrio pequeño y luego lave el vaso de vidrio pequeño 3 veces con agua destilada caliente, usando aproximadamente 3 ml de agua cada vez. y vierta el líquido de lavado dentro de la sala de reacción. Las operaciones restantes se llevan a cabo según la destilación estándar de sulfato de amonio. Debido a la alta concentración de sulfato de potasio en el jugo digestivo, es viscoso y difícil de verter del matraz Kjeldahl. Se debe diluir agregando 5 mL de agua destilada caliente. Si hay cristales precipitados se debe disolver. Calentar ligeramente y añadirlo al vaso mientras esté caliente en la cámara de reacción. Además, también debe prestar atención a agregar la muestra o la solución de control en blanco inmediatamente antes de que el instrumento se enfríe completamente después del lavado; de lo contrario, la solución de digestión precipitará y cristalizará fácilmente a través del tubo de enfriamiento, provocando una obstrucción.
(3) Titulación
Después de destilar la muestra y el blanco, titúlelos juntos. Abra la tapa del frasco receptor y valore con una solución estándar de ácido clorhídrico de 0,0100 mol/L utilizando una microbureta ácida. Cuando la solución en la botella se vuelva gris oscuro, enjuague la pared interior del matraz Erlenmeyer una vez con agua destilada. Si el color verde reaparece después de agitar, agregue con cuidado media gota de solución estándar de ácido clorhídrico, agite y observe el cambio de color de la solución en la botella. Si el color gris oscuro no cambia en uno o dos minutos, se considera que ha desaparecido. alcanzó el punto final de la titulación. Si se vuelve rosa, indica que se ha excedido el punto final de la titulación y se pueden restar 0,02 ml de la cantidad de solución estándar de ácido clorhídrico consumida en la titulación. El color del punto final de la determinación de nitrógeno de cada grupo de muestras debe ser. exactamente lo mismo. Si el color de la solución en el frasco receptor de la solución de control en blanco no cambia o cambia ligeramente pero no aparece verde, no se requiere titulación. Registre la cantidad de mililitros de solución estándar de ácido clorhídrico consumidos en cada titulación para fines de cálculo.