Introducción a los organismos de inclusión

Definición de ingeniería genética: Bajo ciertas condiciones de crecimiento, E. coli puede acumular ciertas macromoléculas biológicas especiales, que se acumulan densamente en la célula, ya sea envueltas en una membrana o formando una estructura desnuda sin membrana, insoluble en agua. Las estructuras se denominan cuerpos de inclusión (IB).

En el proceso de proliferación del virus, a menudo se forma una estructura de lesión proteica en la célula huésped, que es visible al microscopio óptico. Mayormente redondo, ovalado o amorfo. Generalmente, están compuestos de partículas virales completas o subunidades virales no ensambladas; algunas son productos de respuesta de las células huésped a la infección viral y no contienen partículas virales. Algunos se encuentran en el citoplasma (como los cuerpos de inclusión del virus de la viruela), otros en el núcleo (como el virus del herpes) o tanto en el citoplasma como en el núcleo (como el virus del sarampión). Algunos también tienen nombres especiales, como los cuerpos de inclusión del virus de la viruela llamados cuerpos de Guarnieri y los cuerpos de inclusión del virus de la rabia llamados cuerpos de Negri. Se produce principalmente por la falta de determinados cofactores de plegamiento de proteínas o por la incapacidad de formar enlaces secundarios correctos durante la expresión de proteínas recombinantes o porque el entorno no es el adecuado.

1. El nivel de expresión es demasiado alto. Los estudios han encontrado que los cuerpos de inclusión rara vez se forman cuando la expresión es baja. Las razones pueden ser que la velocidad de síntesis es demasiado rápida, por lo que no hay tiempo suficiente para el plegamiento, los enlaces disulfuro no se pueden emparejar correctamente, hay demasiadas uniones no específicas entre proteínas y la proteína no puede alcanzar suficiente solubilidad, etc. .

2. Composición de aminoácidos de la proteína recombinante: en términos generales, cuantos más aminoácidos contienen azufre, más fácil es formar cuerpos de inclusión y el contenido de prolina obviamente se correlaciona positivamente con la formación de inclusión. cuerpos.

3. El entorno en el que se encuentra la proteína recombinante: los cuerpos de inclusión se forman fácilmente cuando la temperatura de fermentación es alta o el pH intracelular está cerca del punto isoeléctrico de la proteína.

4. La proteína recombinante es una proteína heteróloga de E. coli. Debido a la falta de enzimas necesarias para la modificación postraduccional en eucariotas, se acumula una gran cantidad de intermediarios y es fácil formar cuerpos de inclusión. precipitación. Por tanto, algunas personas utilizan el método de expresión de chaperonas moleculares para aumentar la proporción de proteína soluble.

Antes del rápido desarrollo de la tecnología de recombinación genética, los investigadores habían descubierto que la introducción artificial de proteínas anormales en las células (estas proteínas pueden considerarse proteínas exógenas de las células) se acumulaban y formaban proteínas insolubles. La forma de estos agregados de proteínas es obviamente esférica. Estos materiales esféricos son todos proteínas y se forman mediante la fuerza de enlaces no valentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS) o el clorhidrato de guanidina. Desde que se expresaron proteínas genéticamente modificadas en E. coli, la gente ha descubierto gradualmente que la sobreexpresión de estos genes de proteínas extrañas en las células también da como resultado un estado insoluble.

Georgiou et al. encontraron que los cuerpos de inclusión se formaban cuando las proteínas naturales se expresaban en grandes cantidades en Escherichia coli, como la sobreexpresión de lactamasa y fosfatasa alcalina. Los cuerpos de inclusión de las primeras se encontraban en el periplasma. Los cuerpos de este último se encuentran en el citoplasma. También se han encontrado cuerpos de inclusión o agregados formados cuando se sobreexpresan proteínas recombinantes en otras células huésped, como bacterias, virus y células de mamíferos.

Las inclusiones también se pueden formar bajo alguna presión externa, como la temperatura, que es el principal factor que afecta la formación de inclusiones. Algunas proteínas tienden a formar cuerpos de inclusión a altas temperaturas porque estas proteínas tienden a desnaturalizarse y formar agregados a altas temperaturas. Por lo tanto, algunas personas creen que cuando la proteína tiene una temperatura de fusión alta y una estabilidad conformacional natural alta, los cuerpos de inclusión no se forman fácilmente. Sin embargo, algunos estudios sobre la formación de cuerpos de inclusión in vivo han encontrado que la formación de cuerpos de inclusión precede a la formación de cadenas peptídicas maduras o se produce simultáneamente. Al estudiar la proteína de la punta de la cola P22, se encontró que aunque la proteína de la punta de la cola tiene una alta estabilidad, la estructura está principalmente fragmentada, la temperatura de fusión es de 88°C y no se ve afectada por SDS, proteasas ni inactivación por calor, pero esto La proteína es uno de los pocos modelos de proteínas procarióticas que forman cuerpos de inclusión dentro de las células. Algunas proteínas naturales pueden aumentar en un 25% cuando se expresan a alta temperatura (39,1°C), pero estas proteínas no pueden plegarse a su estado nativo y formar agregados. La cinética de formación de agregados sugiere que estos agregados se forman a partir de intermedios parcialmente plegados. De hecho, estos intermedios plegados forman el estado nativo o forman agregados. Este proceso depende de la temperatura y un aumento de temperatura es beneficioso para la formación de agregados.

Cuando las cadenas peptídicas de proteínas se expresan a altas temperaturas y las cadenas peptídicas sintetizadas se transfieren a bajas temperaturas con suficiente antelación, estas cadenas peptídicas de proteínas volverán a entrar en el proceso de plegamiento. Al mismo tiempo, cuando la proteína de la espiga de la cola se expresó a una temperatura permitida y luego las células se transfirieron a una temperatura alta, estas cadenas peptídicas de proteína permanecieron activas, lo que demuestra que una vez que la proteína se expresa correctamente y se pliega en la conformación correcta, la proteína en la célula La estabilidad y la solubilidad ya no cambian a altas temperaturas. Los intermediarios del plegamiento de proteínas in vivo son significativamente sensibles a los factores de temperatura.

Los cuerpos de inclusión de Chlamydia trachomatis creen que las temperaturas más altas pueden aumentar la velocidad de síntesis de proteínas, la velocidad de plegamiento de los intermediarios que forman agregados y la fuerza de interacción hidrofóbica. Las proteínas expresadas tienden a existir en forma de cuerpos de inclusión.

Otras condiciones de fermentación también afectan la formación de cuerpos de inclusión proteicos. La adición de sacarosa al caldo de fermentación puede reducir en gran medida la formación de cuerpos de inclusión de lactamasa. El papel de la sacarosa puede ser estabilizar la estructura de las proteínas nativas o prevenir la agregación de intermediarios de plegamiento de proteínas. En el proceso de plegamiento y renaturalización de lactamasa in vitro, también se descubrió que agregar sacarosa al tampón de renaturalización puede aumentar la tasa de renaturalización de proteínas. Otros aditivos de crecimiento que promueven la expresión soluble de proteínas recombinantes incluyen etanol (que induce la expresión de proteínas de choque térmico), compuestos de sulfhidrilo o disulfuro de bajo peso molecular (que afectan el estado reducido del periplasma, afectando así la formación de enlaces disulfuro) y NaCl. También hay informes de que los medios de cultivo ricos son beneficiosos para la expresión de proteínas activas. Cuando las condiciones de cultivo no son buenas, como un suministro insuficiente de oxígeno o un control deficiente del pH, se forman fácilmente cuerpos de inclusión.

Los agregados proteicos y los cuerpos de inclusión no sólo existen en la expresión de proteínas recombinantes, sino que son un fenómeno muy extendido. En general, se cree que la agregación de proteínas, ya sea dentro o fuera de las células, es causada por la falla de los intermediarios para completar el plegamiento y formar autoagregación. La formación de cuerpos de inclusión está relacionada con la secuencia de la cadena polipeptídica, la velocidad de expresión, la cantidad de chaperonas disponibles y el entorno de crecimiento. Los cuerpos de inclusión se forman a partir de intermediarios parcialmente plegados de cadenas peptídicas recién sintetizadas durante el proceso de plegado, en lugar de proteínas completamente desplegadas. Esto puede tener un mecanismo similar a la formación de agregados durante la renaturalización in vitro. imágenes de fluorescencia

Se debe considerar la presencia de estas estructuras parcialmente plegadas en cuerpos de inclusión. Sin embargo, debido a las características de los cuerpos de inclusión, es difícil utilizar métodos físicos para detectar la estructura de las cadenas peptídicas de proteínas en los cuerpos de inclusión. Zetlmeissl et al. utilizaron el método del dicroísmo circular y encontraron que la cadena peptídica del agregado mantenía parte de la estructura secundaria. A la misma conclusión se llegó utilizando el método de medición Raman. Utilizando ATR-FTIR, se descubrió que la estructura de la proteína del cuerpo de inclusión contenía más estructuras plegadas no nativas que la proteína nativa y la proteína precipitada con sal. Murry et al. utilizaron métodos inmunológicos para determinar las subunidades de la triptófano sintasa. Después de la renaturalización de la proteína, aparecieron tres formas de proteína: una es un agregado insoluble de alto peso molecular y la otra es una proteína soluble completamente renaturalizada. agregado de bajo peso molecular, y el último agregado es tan inmunológicamente activo como la proteína natural y puede unirse a dos anticuerpos monoclonales, pero los otros tres anticuerpos de la proteína natural no se unen a ella, lo que indica que incluso sin renaturalización, los agregados aún se mantienen. parte de su estado estructural casi natural.

En E. coli, los cuerpos de inclusión pueden aparecer en dos ubicaciones de la célula: el citoplasma y el citoplasma periférico. La ubicación y las características de los cuerpos de inclusión dentro de la célula dependen de cómo se expresa la proteína. Tres lactamasas expresadas, una es una lactamasa natural, una contiene el péptido señal OmpA y la otra elimina completamente el péptido señal de la proteína natural. Cuando se expresa en grandes cantidades, provoca la formación de agregados. el citoplasma periférico, mientras que estos últimos forman agregados en el citoplasma. Estos cuerpos de inclusión tienen diferencias bastante claras en tamaño y forma, que reflejan diferencias en la morfología, composición y conformación de la superficie de las cadenas polipeptídicas que forman los agregados.

El diámetro de los cuerpos de inclusión en el citoplasma de E. coli generalmente está entre 0,2 y 1,5 μm. Las diferentes proteínas tienen diferentes diámetros. Por ejemplo, el tamaño del interferón es de 0,811 μm, mientras que el tamaño de la proquimosina bovina. es 1.281 μm. Los cuerpos de inclusión grandes se pueden ver mediante microscopía óptica. En algunos casos, algunos cuerpos de inclusión son más grandes y tienen un diámetro mayor que el diámetro de E. coli, lo que le da a E. coli una protuberancia. Normalmente, una célula tiene un solo cuerpo de inclusión. Los cuerpos de inclusión nunca son adsorbidos por las membranas y son diferentes a otros orgánulos de las células eucariotas. La microscopía electrónica de transmisión de alta precisión reveló la estructura porosa.

Todos los cuerpos de inclusión tienen una alta densidad y son las estructuras más densas en las células microbianas. La densidad está entre 1,1 y 1,3. La densidad de los cuerpos de inclusión de diferentes proteínas también es diferente. son porosos.

La conformación de los agregados no ha sido estudiada sistemáticamente, pero se sabe que la fuerza de agregación no es el enlace de valencia, sino la principal fuerza de interacción hidrofóbica. En el citoplasma de E. coli hay una gran cantidad de glutatión, que inhibe la formación de enlaces disulfuro. Por tanto, cuando la proteína se expresa en el citoplasma se forman agregados porque no se pueden formar enlaces disulfuro. La centrifugación en gradiente de sacarosa de los cuerpos de inclusión de lactamasa mostró que el 95% de ellos eran componentes proteicos, lo que indica que se agregaron pocos otros componentes proteicos a los agregados y no se encontraron moléculas chaperonas usando métodos inmunológicos. La formación de agregados en el cuerpo no sólo produce cuerpos de inclusión, sino que también provoca enfermedades almidonadas, que también pueden provocar enfermedades en los mamíferos.

La investigación sobre la formación de agregados de proteínas in vivo o in vitro, especialmente la comprensión de cómo las secuencias de aminoácidos evitan la formación de agregados, puede mejorar en gran medida el rendimiento del plegamiento de proteínas in vitro y ayudar a comprender la formación de enfermedades moleculares. Mecanismo in vivo. Algunos cuerpos de inclusión se encuentran en el citoplasma (como los cuerpos de inclusión del virus de la viruela).

Algunos cuerpos de inclusión también tienen nombres especiales, como los cuerpos de inclusión del virus de la viruela llamados cuerpos de Guarnieri y los cuerpos de inclusión del virus de la rabia llamados cuerpos de Vegri. Una vez que se establece un proceso de fermentación estable y repetible, es hora de considerar el paso de extraer los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se encuentran en el citoplasma o periplasma de la célula y la membrana celular debe destruirse para liberar los cuerpos de inclusión.

Los cuerpos de inclusión en la solución también deben separarse de los componentes disueltos en la solución de disrupción y otros componentes insolubles como restos celulares, membranas celulares y ribosomas. El primer paso de la extracción es enfriar el caldo de fermentación y recolectar las células mediante centrifugación o filtración de flujo cruzado. El sedimento celular se suspende en un tampón que contiene una cierta concentración de fuerza iónica (0,4-0,6 mo1). Este tampón debe controlar el pH, la fuerza iónica, la concentración de metales pesados ​​y el entorno redox, y estos factores también deben considerarse en pasos operativos posteriores.

Debido a que los cuerpos de inclusión pueden soportar mayores fuerzas de corte que las células, existen muchos métodos que pueden usarse para alterar las células. Para E. coli, el método más utilizado es el método de homogeneización a alta presión, que puede alterar completamente las células, y este método se puede utilizar a diferentes escalas, y de 2 a 5 ciclos pueden alterar completamente las células. Las células de levadura pueden requerir más circulación debido a sus paredes celulares más elásticas o a la adición de algunas partículas de vidrio al recipiente. Las células también se pueden alterar mediante métodos físicos como el ultrasonido o métodos químicos como reactivos químicos y enzimas como la lisozima y el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).

Los cuerpos de inclusión se pueden filtrar o centrifugar para eliminar otros componentes del líquido de ruptura celular. Estos dos métodos aprovechan las diferentes propiedades físicas de los cuerpos de inclusión. Dado que los volúmenes de cuerpos de inclusión y proteínas solubles son diferentes, se puede utilizar la filtración, que puede reducir los costos operativos y es fácil de ampliar. Algunos experimentos han demostrado que la filtración es un medio eficaz para separar cuerpos de inclusión, pero este método también tiene algunas desventajas: la membrana del filtro se bloquea fácilmente por algunos componentes impermeables, incluso si se utiliza filtración de flujo cruzado o filtración de alto caudal. situación no se puede evitar. Además, dado que la membrana microporosa separa los componentes según su tamaño, algunos restos celulares también se mezclan fácilmente con los cuerpos de inclusión.

La densidad de las proteínas de los cuerpos de inclusión es mucho mayor que la de los restos celulares del mismo volumen, por lo que se puede utilizar la centrifugación para separar los cuerpos de inclusión de otros componentes de la célula. Si los restos celulares no se separan de los cuerpos de inclusión, los componentes de la membrana deben separarse en procedimientos de separación posteriores. A veces, algunas proteínas diana existen en forma solubilizada y se pueden agregar algunas sustancias no polares (como fenol, tolueno) o detergentes antes de la alteración celular. De esta manera, se pueden mejorar los cuerpos de inclusión de la hormona del crecimiento humano expresados ​​​​en E. coli. producir.

La tecnología de centrifugación continua es la operación más utilizada para la obtención de cuerpos de inclusión en la producción industrial. Dado que la densidad de los restos celulares es menor que la de los cuerpos de inclusión, la velocidad de sedimentación es más lenta que la de los cuerpos de inclusión. La suspensión y centrifugación continuas pueden centrifugar la mayoría de los cuerpos de inclusión y los restos celulares se eliminan gradualmente.

El análisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio) encontró que el método de centrifugación puede lograr un contenido de proteína superior al 90% en el sedimento.

Diagrama de fluorescencia de cuerpos de inclusión

Cuando los restos celulares y los cuerpos de inclusión se mezclan y son difíciles de separar, se pueden utilizar algunos métodos químicos para separar los restos celulares, cromatografía de intercambio iónico, proteínas renaturalizadas y cuerpos de inclusión. De lo contrario, después de disolver los cuerpos de inclusión, las proteínas de la membrana se disolverán en la solución de proteína del cuerpo de inclusión, lo que contaminará las operaciones posteriores. Especialmente si algunas proteínas de membrana tienen actividad proteasa, las proteínas del cuerpo de inclusión después de la solubilización pueden degradarse. Si algunos disolventes utilizados para disolver las proteínas de la membrana celular procariótica no pueden disolver las proteínas del cuerpo de inclusión, las proteínas de la membrana se pueden eliminar disolviéndolas. El método más común para solubilizar selectivamente proteínas de membrana es utilizar reactivos metálicos quelantes como EDTA, detergentes neutros como Triton X-100 o algunas sales como desoxicolato o agentes caotrópicos débiles como 2 mol/L de urea. Babbit et al. descubrieron que el rendimiento de renaturalización de la sarcosina quinasa podría aumentarse mediante los pasos anteriores. La razón del aumento de la actividad fue el uso del detergente débil octilosa para eliminar la proteasa.

Tanto la centrifugación como la homogeneización a alta presión pueden producir espuma, por lo que esta pérdida derrochadora debe evitarse a escala industrial. En algunas producciones industriales, las células se matan en un tanque de fermentación antes de la separación para liberar sustancias intracelulares y disolver o no las proteínas del cuerpo de inclusión al mismo tiempo. Este método de matar células en línea se ha utilizado para producir dos proteínas: solubilizar factores de crecimiento similares a la insulina en condiciones alcalinas y producir péptidos antifúngicos recombinantes en condiciones ácidas y de alta temperatura. La ventaja de este método es que puede ahorrar tiempo de funcionamiento y consumo de energía y solo requiere un paso de centrifugación. Los reactivos de destrucción celular más utilizados son el alcohol feniletílico, el ácido octanoico, el cloroformo, el tolueno, etc. También existen desventajas al matar células. La proteína objetivo disuelta contiene sustancias proteicas o no proteicas, lo que reduce la pureza de la proteína. Si la proteína objetivo no se disuelve, matar las células hará que la proteína soluble precipite, lo que dificultará la purificación. de los cuerpos de inclusión es imposible. Es más difícil, o la proteína recombinante dentro del cuerpo de inclusión se destruye. La fuerza que mantiene la estructura de la proteína en el cuerpo de inclusión es una fuerza intramolecular, y esta fuerza también mantiene la estructura estable de la proteína nativa. Se ha informado anteriormente que esta fuerza es causada por un enlace valente, pero parece consistente que es un enlace no valente el que mantiene la estructura apretada de la proteína dentro del cuerpo de inclusión. Los enlaces disulfuro, ya sean correctos o incorrectos, no desempeñan ningún papel directo en el mantenimiento de la estructura firme de la proteína interna. El primer paso más común para obtener proteínas activas es disolver estas proteínas de inclusión. La solución disolvente es un componente que desnaturaliza completamente estas proteínas de inclusión, una vez disueltas, entran en el proceso de plegamiento in vitro de las proteínas.

Solubilización de cuerpos de inclusión La solubilización de proteínas de cuerpos de inclusión también es un paso clave en el proceso. La elección del solvente afectará las operaciones posteriores, el rendimiento final de varias proteínas y el costo final. Se deben seguir los siguientes estándares:

⑴ Cinética de disolución rápida

⑵ La unión. a las proteínas es reversible

⑶ No hay interferencia con el método de separación de los desechos celulares

⑷ No depende de la temperatura

⑸ Inhibición de la degradación enzimática; /p>

⑹ Sin modificación química con el grupo amino de la proteína;

⑺ Cuando sea posible, elija la concentración de disolución más baja y un solvente barato, y sea adecuado para uso futuro. El método de replegamiento. Los agentes más comúnmente utilizados para solubilizar cuerpos de inclusión incluyen agentes caotrópicos o detergentes.

Los agentes caotrópicos iónicos más utilizados para disolver y preparar proteínas fueron desarrollados por primera vez por Hatefi et al. en 1969. Los detergentes iónicos como el SDS son otro tipo de proteínas de cuerpo de inclusión y reactivos de membrana solubilizantes. Por lo general, no se utilizan para la producción a gran escala, sino con fines cualitativos. Además de los ácidos fuertes, las bases fuertes y el uso de disolventes orgánicos para extraer proteínas altamente hidrófobas, en la producción industrial a gran escala rara vez se utilizan otros métodos de desnaturalización, como la modificación valente irreversible. Una vez que la proteína se disuelve, los grupos sulfhidrilo de la proteína se oxidan fácilmente y rápidamente y forman agregados altamente valerosos o enlaces disulfuro intramoleculares no coincidentes, y luego estas proteínas ya no pueden plegarse. Para evitar la oxidación, estos grupos se pueden mantener en un estado reducido o formar sulfonatos o enlaces disulfuro mixtos utilizando tampones que contienen reactivos de tiol de bajo peso molecular.

El detergente es el método más económico para solubilizar proteínas con cuerpos de inclusión. Una de las mayores ventajas es que la proteína solubilizada puede mantener una actividad biológica completa, lo que indica que la estructura cuaternaria de la proteína se mantiene en estas condiciones. Lo más importante es que la agregación de proteínas después de la dilución es menor que la de otros disolventes. Se pueden utilizar detergentes catiónicos, aniónicos y no iónicos, y la concentración utilizada es generalmente superior a la concentración micelar crítica (CMC) del detergente, normalmente del 0,5 al 5%.

El SDS sólo se utiliza en la producción masiva de la hormona del crecimiento bovino, el interferón y la interleucina-2. El SDS unido a moléculas de proteínas es más difícil de eliminar debido a su menor concentración micelar crítica (CMC). Dado que la N-dodecilsarcosina tiene una CMC un 0,4 % superior a la del SDS, también se utiliza para disolver las proteínas del cuerpo de inclusión y renaturalizar las proteínas mediante dilución. El detergente restante se puede utilizar mediante cromatografía de intercambio aniónico o método de ultrafiltración. Este detergente es un detergente relativamente suave que puede disolver selectivamente algunos cuerpos de inclusión, pero no puede disolver agregados de proteínas y moléculas de proteínas completamente desnaturalizadas en la membrana interna de E. coli. Una desventaja importante del uso de detergentes es la interferencia con las etapas posteriores de purificación y renaturalización. Los detergentes se unen a las proteínas más fuertemente que las proteínas renaturalizadas mediante cromatografía de intercambio iónico, son difíciles de eliminar e interfieren con el intercambio iónico y la hidrofobicidad en el proceso de cromatografía de interacción. la membrana de ultrafiltración adsorberá estos desnaturalizantes en concentraciones desnaturalizantes. Por lo tanto, es necesario lavar estos detergentes tanto como sea posible después de la renaturalización. También puede utilizar ciclodextrina, dextrina en cadena o almidón cíclico para extraer el detergente del tampón de renaturalización.

Un problema que no se puede ignorar es que los detergentes pueden disolver todas las proteasas de las proteínas de membrana. La actividad de estas proteasas se activa en presencia de detergentes, lo que puede provocar la disolución y la renaturalización. . El rendimiento de la renaturalización de proteínas se puede mejorar mediante los siguientes métodos:

a) Lavar las proteínas del cuerpo de inclusión tanto como sea posible con antelación utilizando un disolvente que pueda disolver las proteínas de la membrana pero no las proteínas del cuerpo de inclusión;

b) Se eliminan completamente los fragmentos bacterianos contenidos en los cuerpos de inclusión;

c) El líquido que disuelve los cuerpos de inclusión contiene inhibidores de enzimas proteicas, como EDTA, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), etc. . También se utilizan otros agentes caotrópicos para disolver las proteínas del cuerpo de inclusión. Los agentes caotrópicos más importantes que disuelven las proteínas del cuerpo de inclusión son el clorhidrato de guanidina y la urea. Estos son los reactivos de disolución más utilizados. Generalmente, se selecciona una concentración de 6-8 mol/L. La concentración es de 1 a 10 mg/ml.

En el proceso de disolución de la triptófano sintasa A, se encontró que el orden de solubilidad de los cationes es Gdm+ > Li+ > K+ > Na+, y el orden de los aniones es SCN- > I- > Br- > Cr-. Algunos caotropos no son adecuados para disolver cuerpos de inclusión debido a la mayor densidad y viscosidad de sus soluciones que el clorhidrato de guanidina y la urea, que son difíciles de separar mediante centrifugación y cromatografía.

La concentración de urea o clorhidrato de guanidina necesaria para disolver las proteínas del cuerpo de inclusión varía en función de la proteína. Si la concentración de desnaturalizante requerida para la solubilización de la forma nativa de la proteína no está disponible, es necesario determinar primero la concentración del agente caotrópico al solubilizar los cuerpos de inclusión.

Escherichia coli

Debido a que el clorhidrato de guanidina es relativamente costoso, generalmente se usa para disolver algunas moléculas de proteínas farmacológicas con alto valor agregado. Se elige clorhidrato de guanidina como reactivo de disolución porque el clorhidrato de guanidina lo es. a Es un desnaturalizante más fuerte que la urea y puede incluso disolver cuerpos de inclusión que la urea no puede disolver; la urea puede estar contaminada por cianatos formados espontáneamente o por cianatos existentes, especialmente en ambientes alcalinos, provocando así una modificación irreversible de los grupos amino libres de la proteína. El método para eliminar este efecto es utilizar un sistema tampón aniónico como Tris-HCl para disolver la urea o purificar la urea mediante cromatografía de intercambio aniónico antes de su uso, y el tampón de disolución y renaturalización preparado se utiliza el mismo día. Los factores que afectan la desnaturalización de las proteínas en la solución de urea son diferentes a los del clorhidrato de guanidina. Las proteínas disueltas en urea se ven afectadas por el pH y la fuerza iónica, que afectan las interacciones de carga entre los residuos de proteínas, pero dado que el clorhidrato de guanidina contiene altas concentraciones de fuerza iónica, estos dos factores tienen poco efecto. En general, los detergentes no se usan en combinación. Lilly et al. encontraron que la concentración molar efectiva de una mezcla de detergente y urea es baja.

Mezclar urea y sales tipo detergente puede desnaturalizar las proteínas, pero la urea y las sales no detergentes, como el cloruro de sodio, en realidad pueden reducir la solubilidad de las proteínas del cuerpo de inclusión, por lo que se debe evitar su uso.

Los detergentes también se utilizan en combinación con otros reactivos o potenciadores de la disolución. Se ha descubierto que la urea y el ácido acético, la urea y el sulfuro de dimetilo, la urea y el pH alto son métodos más eficaces para disolver las proteínas del cuerpo de inclusión.

La alta presión (1-2 kbar) y los ultrasonidos también pueden disolver las proteínas del cuerpo de inclusión. En este momento, la concentración del reactivo de disolución utilizado puede ser relativamente baja para facilitar los pasos de renaturalización posteriores. El pH también es una forma relativamente barata y eficaz de disolver los cuerpos de inclusión. Los ácidos más utilizados son los ácidos orgánicos, con concentraciones que oscilan entre el 5 y el 80%. Gavif y Better utilizaron temperaturas bajas (pH ≤ 2,6) y altas (85 °C) para disolver segmentos de péptidos de proteínas recombinantes antifúngicos. Las temperaturas bajas y el pH alto requieren tiempos de disolución más prolongados. Reddy y sus colaboradores también utilizaron ácido acético al 20% para disolver una proteína unida a maltosa. Sin embargo, las mismas modificaciones irreversibles o degradación ácida pueden ocurrir a pH extremos, por lo que este método no se usa comúnmente para disolver cuerpos de inclusión.

El pH alto (≥12) también se utiliza para disolver la hormona del crecimiento y la proinsulina. Algunas proteínas también pueden sufrir una desnaturalización irreversible a pH alto debido al proceso de desulfuración de la cisteína en condiciones alcalinas. Por lo tanto, aunque este método es relativamente simple y económico, solo se usa para algunas proteínas específicas, especialmente para proteínas farmacéuticas, este método generalmente no se usa. 1. Las proteasas de las células atacan fácilmente las proteínas solubles y la expresión de cuerpos de inclusión puede evitar la degradación de proteínas extrañas por las proteasas.

2. Reducir la concentración de proteínas exógenas dentro y fuera de la célula, lo que resulta beneficioso para la mejora de la expresión.

3. El contenido de proteínas impurezas en los cuerpos de inclusión es bajo y solo se necesita una simple centrifugación a baja velocidad para separarlo de las proteínas solubles, lo que favorece la separación y la purificación.

4. No es sensible a la agitación mecánica ni a la alteración ultrasónica, y es fácil de romper la pared y separarse de los fragmentos de la membrana celular.