Tecnología de secuenciación de secuenciación de ADN

La tecnología de secuenciación de alto rendimiento (High-throughput sequencing), también conocida como tecnología de secuenciación de "próxima generación" (tecnología de secuenciación de próxima generación), puede realizar un procesamiento paralelo de cientos de miles a millones de moléculas de ADN. a la vez. La determinación de la secuencia y, en general, las longitudes de lectura cortas son indicadores.

Según la historia del desarrollo, la influencia, los principios y las tecnologías de secuenciación, existen principalmente los siguientes tipos: secuenciación masiva de firmas paralelas (MPSS), clonación de polimerasa (secuenciación polony), pirosecuenciación 454 (pirosecuenciación 454), Illumina ( Solexa), secuenciación ABI SOLiD, secuenciación de semiconductores de iones (Ion semiconductor sequencing), secuenciación de nanobolas de ADN, etc. El analizador genético (es decir, el secuenciador de ADN) utiliza tecnología de electroforesis capilar para reemplazar la electroforesis tradicional en placas de poliacrilamida y aplica el ddNTP (método de terminador marcado) marcado con tinte fluorescente de cuatro colores patentado por la compañía, lo que se genera a través de una reacción de secuenciación por PCR de cebador único. El producto de la PCR es una mezcla de ADN monocatenario con cuatro tintes fluorescentes diferentes en los extremos 3' que difieren en una base, de modo que los productos de la PCR de secuenciación de los cuatro tintes fluorescentes se pueden someter a electroforesis en un tubo capilar, evitando así la migración entre carriles. La influencia de la diferencia de tasas mejora enormemente la precisión de la secuenciación. Dado que las moléculas tienen diferentes tamaños, su movilidad en la electroforesis capilar también es diferente. Cuando pasan a través de la ventana de lectura capilar, el detector de cámara CCD (dispositivo de carga acoplada) en la ventana del detector láser puede detectar las moléculas fluorescentes una por una y excitarlas. La fluorescencia se separa mediante una rejilla para distinguir diferentes colores de fluorescencia que representan información de base diferente y se obtienen imágenes simultáneamente en una cámara CCD. El software de análisis puede convertir automáticamente las diferentes fluorescencias en secuencias de ADN para lograr el propósito de la secuenciación de ADN. Los resultados del análisis se pueden generar en diversas formas, como patrones de electroforesis en gel, diagramas de picos de absorción de fluorescencia o secuencias de disposición de bases.

Es un instrumento de precisión de alta gama capaz de realizar el llenado automático de gel, la introducción automática de muestras, la recopilación y el análisis automáticos de datos y otras determinaciones totalmente automáticas controladas por computadora de la secuencia de bases o el tamaño y la cuantificación de fragmentos de ADN. . PE Company también proporciona polímeros en gel, incluido el gel de secuenciación de ADN (POP 6) y el gel GeneScan (POP 4). Los tamaños de poro de estas partículas de gel son uniformes, lo que evita el impacto de condiciones de preparación de gel inconsistentes en la precisión de la secuenciación. Consiste principalmente en un dispositivo de electroforesis capilar, una computadora Macintosh, una impresora a color y electroforesis y otros accesorios. La computadora incluye software para la recopilación de datos, el análisis y la operación del instrumento. Utiliza el último detector de cámara CCD para acortar la secuenciación de ADN a 2,5 horas y el análisis del tamaño de los fragmentos de PCR y el análisis cuantitativo de 10 a 40 minutos.

Dado que este instrumento tiene funciones como secuenciación de ADN, análisis del tamaño de fragmentos de PCR y análisis cuantitativo, puede realizar secuenciación de ADN, análisis de heterocigotos, análisis de polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP), análisis de secuencia de microsatélites, La PCR de segmentos, la RT-PCR (PCR cuantitativa) y otros análisis, además de la secuenciación de ADN convencional, también se pueden utilizar para el análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), la detección de mutaciones genéticas, la coincidencia de HLA y la medicina forense en la práctica clínica. pruebas individuales, tipificación e identificación de microorganismos y virus, etc.

1. Preparación

1. El reactivo principal del kit de reacción de secuenciación BigDye es BigDye Mix, que contiene ddNTP patentado de PE de cuatro colores marcado con fluorescencia y dNTP ordinario, ADN polimerasa FS AmpliTaq. Tampón de reacción, etc.

2. Plantilla de control de ADN bicatenario pGEM-3Zf (+) 0,2 g/L, reactivos de soporte del kit.

3. Cebador M13(-21) TGTAAAACGACGGCCAGT, 3,2 μmol/L, es decir, 3,2 pmol/μl, reactivo de soporte del kit.

4. La plantilla de secuenciación de ADN puede ser producto de PCR, ADN monocatenario, ADN plasmídico, etc. La concentración de la plantilla debe ajustarse a 1 µl durante la reacción de PCR. La concentración de ADN plasmídico medida en este experimento fue de 0,2 g/l, es decir, 200 ng/μl.

5. El cebador debe diseñarse como cebador directo o inverso según el fragmento de ADN que se vaya a medir y prepararse a 3,2 μmol/L, es decir, 3,2 pmol/μl. Si el plásmido recombinante contiene una secuencia de cebador universal, también se pueden usar cebadores universales, tales como el cebador M13(-21), el cebador T7, etc.

6. Agua desionizada esterilizada o agua triple destilada.

7. 0,2 ml o separar del tapón del tubo PCR de 0,5 ml.

8. 3 mol/L de acetato de sodio (pH 5,2) Pesar 40,8 g NaAc·3H2O y disolverlo en 70 ml de agua destilada, ajustar el pH a 5,2 con ácido acético glacial, diluir a 100 ml. y esterilizar en autoclave después del embalaje.

9. Etanol 70% y etanol absoluto.

10. Mezcla NaAc/etanol. Mezclar 37,5 ml de etanol absoluto y 2,5 ml de NaAc 3 mol/L. Se puede conservar a temperatura ambiente durante 1 año.

11. Gel secuenciador POP 6.

12. Reactivo de supresión de plantilla (TSR).

13. Tampón de electroforesis 10×.

14. Secuenciador de ADN totalmente automático.

15. Instrumento PCR.

16. Centrífuga refrigerada de alta velocidad de sobremesa.

17. Centrifugadora de sobremesa de alta velocidad o centrífuga de bolsillo.

2. Reacción de secuenciación de PCR

1. Tome un tubo de PCR de 0,2 ml, numérelo con un marcador, inserte el tubo en hielo granulado y agregue los reactivos de acuerdo con la siguiente tabla:

Reactivos añadidos para la determinación del tubo plantilla y del tubo de control estándar

BigDye Mix 1 μl 1 μl

ADN plásmido a analizar 1 μl -

pGEM- 3Zf (+) ADN bicatenario – 1 μl

Cebador directo del ADN a analizar 1 μl –

Cebador M13(-21) – 1 μl

Agua desionizada estéril 2 μl 2 μl

El volumen total de reacción es de 5 μl. No agregue aceite mineral ligero ni aceite de parafina, mezcle el tubo con el dedo. y centrifugar ligeramente.

2. Coloque el tubo de PCR en la máquina de PCR 9600 o 2400 para su amplificación. Después de la desnaturalización a 98 °C durante 2 min, se realizó el ciclo de PCR. Los parámetros del ciclo de PCR fueron 96 °C durante 10 s, 50 °C durante 5 s y 60 °C durante 4 min, 25 ciclos. temperatura de incubación a 4°C.

3. Purificación del producto de PCR mediante el método de acetato de sodio/etanol

1. Centrifugar la mezcla y transferir el producto de amplificación a un tubo EP de 1,5 ml.

2. Añadir 25 μl de la mezcla de acetato de sodio/etanol, agitar bien y colocar en hielo durante 10 minutos para precipitar el ADN. Centrifugar a 12 000 r/min durante 30 min a 4°C y desechar con cuidado el sobrenadante.

3. Añadir 50 μl de etanol al 70% (V/V) para lavar el pellet dos veces. Centrifugar a 12 000 r/min durante 5 min a 4 °C. Desechar con cuidado el sobrenadante y las perlas líquidas de la pared del tubo y secar al vacío el precipitado durante 10 a 15 min.

4. Procesamiento de los productos de secuenciación de PCR antes de la electroforesis.

1. Añadir 12 μl de TSR al tubo de centrífuga, agitar vigorosamente para disolver completamente el precipitado de ADN y centrifugar ligeramente.

2. Transfiera la solución a un tubo de PCR de 0,2 ml con tapa independiente y centrifugue ligeramente.

3. Realice la desnaturalización térmica en una máquina de PCR (95 °C durante 2 minutos), enfríe en hielo y espere su uso en la máquina.

5. Operación en la máquina 1. Instale el capilar de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del instrumento, corrija la posición del capilar, llene manualmente el gel y establezca el archivo de secuencia de secuenciación para la ejecución. 2. El instrumento llenará automáticamente el gel en el capilar, realizará una preelectroforesis a 1,2 kV durante 5 minutos, inyectará muestras automáticamente según la secuencia programada, luego preelectroforesis (1,2 kV, 20 min) y electróforos a 7,5 kV. durante 2 horas.

3. Después de la electroforesis, el instrumento se limpiará automáticamente, llenará el gel, ingresará la siguiente muestra, preelectroforesis y electroforesis. 4. El tiempo total de electroforesis para cada muestra es de 2,5 horas. 5. Después de la electroforesis, el instrumento analizará o imprimirá automáticamente un mapa de secuenciación de colores.

6. Análisis de secuencia El instrumento realizará automáticamente un análisis de secuencia y puede realizar una comparación de secuencia según los requisitos del usuario. Si se conoce la secuencia de secuenciación, las bases de diferencia se pueden marcar con asteriscos mediante la comparación de secuencias para mejorar la eficiencia del trabajo.

7. Limpieza del instrumento: Después de la secuencia, realice la limpieza y el mantenimiento del instrumento de acuerdo con los procedimientos operativos del instrumento.

8. Cálculo

1. Fórmula de cálculo de la precisión de la reacción de secuenciación: 100% - número de bases de diferencia (excluyendo el número N)/650×100%.

2. Las bases de diferencia se refieren a las bases que son diferentes entre la secuencia de ADN medida y la secuencia de ADN estándar conocida. N es la base que no puede leer el instrumento. El sistema de secuenciación de ADN SILVER SEQUENCETM es un sistema de análisis de secuencia no radiactivo que detecta bandas en geles mediante un método sensible de tinción con plata. La tinción con plata proporciona una alternativa más rápida y económica a los métodos radiactivos o fluorescentes. Los resultados de la secuenciación se pueden obtener el mismo día; la secuencia se puede leer dentro de los 90 minutos posteriores a la finalización de la electroforesis, lo cual es imposible con los métodos de secuenciación radiactiva convencionales. Además, el sistema SILVER SEQUENCETM utiliza oligonucleótidos 5'OH no modificados como cebadores, lo que reduce el costo de los oligonucleótidos especialmente modificados. Este sistema no requiere la manipulación cuidadosa de los isótopos que se encuentran en los métodos radiactivos, ni requiere los costosos reactivos de las técnicas de fluorescencia o quimioluminiscencia. Además, no hay necesidad de instrumentos para detectar bandas de secuencia, como ocurre con la mayoría de los métodos de fluorescencia.

La ADN polimerasa Taq es extremadamente termoestable a 95°C. La ADN polimerasa Taq de grado de secuenciación utilizada en este sistema es un producto modificado de la ADN polimerasa Taq. Tiene un efecto muy bueno en las plantillas de ADN de doble cadena, tiene un alto grado de precisión, puede producir bandas uniformes y tiene un fondo bajo.

El sistema SILVER SEQUENCETM contiene una mezcla de nucleótidos modificada, como 7-deaza dGTP (dITP) en lugar de dGTP, que puede eliminar la compresión de bandas causada por regiones ricas en GC.

La temperatura de recocido es el factor más importante en la secuenciación del ciclo térmico. Las altas temperaturas de recocido reducen la estructura secundaria de la plantilla. Mejore la rigurosidad del emparejamiento de imprimación y plantilla. La reasociación de cadenas y la estructura secundaria de la plantilla limitan la capacidad de obtener datos de secuencia claros a partir de productos de PCR de fragmentos pequeños (<500 pb). La extensión del cebador comienza con la fase de recocido de cada ciclo. A temperaturas más bajas, la polimerasa puede encontrar regiones de estructura secundaria fuerte que pueden provocar que la polimerasa se disocia. Luego hay bandas en la misma posición relativa en los cuatro carriles de electroforesis. Por estas razones, se debe utilizar la temperatura de recocido más alta posible. Para plantillas con estructuras secundarias fuertes, se recomienda utilizar el modo de ciclo de desnaturalización a 95 °C y recocido/extensión a 70 °C. En términos generales, los cebadores más largos y los cebadores con alto contenido de GC producirán señales más fuertes. Los resultados experimentales muestran que los cebadores con un contenido de GC >24 meros de aproximadamente el 50 % pueden lograr los mejores resultados.

Debido a que este sistema utiliza un ciclador térmico, tiene las siguientes ventajas en comparación con los métodos de secuenciación convencionales: (1). Este método amplifica linealmente el ADN molde para producir suficientes productos que permitan que la tecnología de tinción con plata detecte secuencias. tiras, la reacción de secuenciación requiere de 0,03 a 2 pmol de ADN molde, dependiendo del tipo de molde. (2). La alta temperatura en cada ciclo de desnaturalización puede reemplazar los procesos de desnaturalización alcalina y precipitación con etanol de las plantillas de ADN bicatenario (ADNds). El ciclo de desnaturalización también ayuda a eliminar los problemas causados ​​por el rápido recocido de plantillas de ADNds lineales (). como los productos de reacción de PCR). (3). La reacción de la polimerasa a alta temperatura debilita la estructura secundaria de la plantilla de ADN, permitiendo que la polimerasa pase a través de regiones con estructura altamente secundaria.

1. Preparación de reactivos

1. Kit de secuenciación de ADN SILVER SEQUENCETM.

2. Solución madre de acrilamida y metilen bisacrilamida (38% acrilamida p/v, 2% metilen bisacrilamida p/v): 95 g de acrilamida, 5 g de metilen bisacrilamida Disolver acrilamida en 140 ml de agua bidestilada. ajuste el volumen a 250 ml, fíltrelo con un filtro de 0,45 mm, guárdelo en un frasco marrón y guárdelo en refrigerador a 4°C durante 2 semanas.

3. Disolver persulfato de amonio al 10%, 0,5 g de persulfato de amonio en 4 ml de agua, diluir a 5 ml y prepararlo para un nuevo uso.

4. Tampón 10×TBE (1 mol/L Tris, 0,83 mol/L ácido bórico, 10 mmol/L EDTA): 121,1 g Tris, 51,35 g ácido bórico, 3,72 g Na2EDTA·2H2O, disuelto Diluir a 1 litro en agua bidestilada y almacenar durante 2 semanas a 4°C. Su pH es aproximadamente 8,3.

5. Tampón de electrodo TBE: 10×TBE buffer diluido a 1×TBE para su uso posterior.

6. TEMED

7. Solución fijadora/parada: Preparar 2 litros de ácido acético glacial al 10% (V/V) para su uso posterior.

8. Solución colorante: 2 g de nitrato de plata, 3 ml de formaldehído, disueltos en 2 litros de agua ultrapura y reservado.

9. Solución de desarrollo: 60 g de carbonato de sodio (Na2CO3) disueltos en 2 litros de agua ultrapura, añadir 3 ml de formaldehído al 37% y 40 ml de solución de tiosulfato de sodio (10 mg/ml) antes de su uso.

10. 95% de etanol.

11. Ácido acético glacial al 0,5%.

12. Sigmacote (Sigma CAT.#SL-2).

2. Reacción de secuenciación

1. Para cada conjunto de reacciones de secuenciación, etiquete cuatro tubos eppendorf de 0,5 ml (G, A, T, C). Agregue 2 ml de la mezcla d/ddNTP adecuada a cada tubo. Agregue 1 gota (aproximadamente 20 μl) de aceite mineral a cada tubo, cubra el tubo y guárdelo en hielo o a 4°C para su uso posterior.

2. Para cada conjunto de cuatro reacciones de secuenciación, mezcle los siguientes reactivos en un tubo eppendorf:

(1) Reacción de muestra:

ADN plantilla de plásmido: 2,1 pmol

tampón de secuenciación 5×: 5 ml

cebadores: 4,5 pmol

ddH2O estéril hasta volumen final 16 ml

(2 ) Reacción de control

pGEM-3Zf (+) ADN de control (4 mg): 4,0 ml

tampón de secuenciación 5×: 5 ml

pUC /M13 forward cebador (4,5 pmol): 3,6 ml

3. Agregue 1,0 ml de ADN polimerasa Taq de grado de secuenciación (5 μ/ml) a la mezcla de cebador/plantilla (paso 2 anterior). Utilice una pipeta para mezclar varias veces.

4. Agregue 4 ml de la mezcla de enzima/cebador/plantilla del paso 3 en el tubo de cada mezcla de d/ddNTP.

5. Centrifugar en una microcentrífuga hasta que toda la solución esté en el fondo del tubo eppendorf.

6. Colocar el tubo de reacción en un termociclador precalentado a 95°C e iniciar el programa de ciclo según el modo de circulación del medio. Se debe elegir la temperatura de recocido óptima para cada combinación de imprimador/plantilla. El siguiente programa normalmente leerá 350 bases del cebador.

7. Una vez completado el programa del ciclo térmico, agregue 3 μl de solución de parada de secuenciación de ADN a cada tubo y gírelo brevemente en una microcentrífuga para finalizar la reacción.

Nota

(1) La cantidad de ADN plantilla utilizada para la secuenciación generalmente se agrega de acuerdo con los siguientes requisitos:

Tipo de plantilla/longitud cantidad de plantilla

200 pb (producto de PCR): 16 ng (120 fmol)

3000～5 000 pb (ADN plasmídico superenrollado): 4 mg (2 pmol)

48 000 pb (λ, ADN cósmido): 1 mg (31 fmol)

Dado que la señal generada por los plásmidos superenrollados es más débil que la del ADN bicatenario lineal relajado, la cantidad de plásmidos superenrollados utilizados como plantillas es más grande que el de otras plantillas.

(2) La siguiente fórmula general se puede utilizar para calcular el número de nanogramos de cebador equivalente a 4,5 pmol:

4,5 pmol=1,5 ng×n, donde n es el número de bases de cebador

La siguiente fórmula general se puede utilizar para calcular el número de microgramos de cebador equivalentes a 1p mol:

ADNds: 1 pmol= (6,6×10mg)×n, donde n es el número de pares de bases plantilla

ADNss: 1pmol=(3,3×10 mg)×n, donde n es el número de bases plantilla

(3) Para prevenir el ADN Taq Para evitar que la polimerasa extienda cebadores de recocido no específicos, el termociclador debe precalentarse a 95 ℃. Los cambios de temperatura deben ser lo más rápidos posible. Los tiempos de ciclo siguientes no incluyen el tiempo de rampa. Si no está seguro de qué modo utilizar, se recomienda comenzar con el Modo 1.

Modo 1: Adecuado para imprimaciones <24 bases o contenido de GC <50%

95 ℃ durante 2 minutos, luego: 95 ℃ durante 30 segundos (desnaturalización), 42 ℃ durante 30 segundos segundos (recocido), 70°C durante 1 minuto (extensión).

Modo 2: Adecuado para ≥24 bases o primers ligeramente más cortos con contenido de GC ≥50%.

95 ℃ durante 2 minutos, luego: 95 ℃ durante 30 segundos (desnaturalización), 70 ℃ durante 30 segundos (recocido/extensión).

(4) Después de añadir la solución de parada, la muestra se puede almacenar a 4°C durante la noche.

3. Preparación de las placas de gel de secuenciación

1. Manipulación de las placas de vidrio

Las placas de vidrio para la secuenciación teñidas de plata deben estar muy limpias, normalmente con agua tibia. Primero lave con agua con detergente, luego enjuague la placa de vidrio con agua desionizada para eliminar el detergente residual y finalmente limpie la placa de vidrio con etanol. Un microfilm de detergente dejado en la placa de vidrio puede provocar un fondo alto (marrón) al teñir el gel. Las placas de vidrio cortas se tratan con una solución adhesiva para reticular químicamente el gel con la placa de vidrio. Este paso es fundamental para evitar que el gel se rompa durante el procedimiento de tinción con plata.

(1) Tratamiento de placas de vidrio cortas

① Agregue 5 ml de silano aglutinante (Bind Silane) a 1 ml de etanol al 95 % y ácido acético glacial al 0,5 % para preparar adhesivo nuevo. . solución combinada.

② Limpie la placa de vidrio que ha sido cuidadosamente limpiada y secada de forma natural con un paño absorbente empapado en la solución adhesiva recién preparada. Se debe limpiar toda la superficie de la placa.

③ Después de 4 a 5 minutos, limpie la placa de vidrio con etanol al 95% en una dirección y luego límpiela en dirección vertical con una ligera fuerza. Repita este proceso de limpieza tres veces, utilizando papel limpio cada vez para eliminar el exceso de solución adhesiva.

Nota

① Una fuerza excesiva al limpiar la placa de vidrio con etanol al 95% en una dirección eliminará demasiado silano adhesivo e impedirá que el gel se adhiera bien.

② Cámbiese los guantes antes de preparar placas de vidrio largas para evitar la contaminación del adhesivo silano.

③ Es importante evitar que la solución adhesiva contamine la placa de vidrio larga, de lo contrario provocará que el gel se rompa.

(2) Tratamiento de placas de vidrio largas:

① Limpie las placas de vidrio largas limpias con un pañuelo de papel empapado en solución de Sigmacote.

② Después de 5 a 10 minutos, limpie la placa de vidrio con un paño absorbente para eliminar el exceso de solución de Sigmacote.

Nota

① El gel usado se puede remojar en agua y luego raspar con una hoja de afeitar o un raspador de plástico. Los paneles de vidrio deben limpiarse a fondo con detergente. O el gel se puede remojar en NaOH al 10 % y retirar. Para evitar la contaminación cruzada, las herramientas utilizadas para limpiar placas de vidrio cortas deben separarse de las herramientas utilizadas para limpiar placas de vidrio largas. Si se produce contaminación cruzada, los geles preparados posteriormente pueden romperse o soltarse.

2. Preparación del gel

(1) Después de tratar la placa de vidrio con gel de sílice adherido y Sigmacote, se puede fijar la placa de vidrio. Este método consiste en colocar tiras de borde de 0,2 mm o 0,4 mm de espesor en los lados izquierdo y derecho de la placa de vidrio y presionar otra placa de vidrio encima. Inserte el borde plano del peine con dientes de tiburón en un lado de la placa de vidrio larga y asegúrelo con un clip.

(2) Según la concentración de gel requerida, prepare el gel de secuenciación de acuerdo con la siguiente tabla. Generalmente, una concentración de gel del 6 % al 8 % puede obtener mejores resultados.

Durante el proceso de preparación, primero use una cantidad adecuada de agua bidestilada para disolver la urea, luego agregue Acr&Bis y tampón 10×TBE, luego use agua bidestilada para ajustar el volumen final a 99,2 ml y filtre con un filtro de 0,45 mm. membrana, luego agregue persulfato de amonio y TEMED. No es necesario calentar para disolver la urea. Si es necesario calentar, se deben agregar TEMED y persulfato de amonio solo después de que la solución se haya enfriado por completo. Generalmente, la polimerización comienza de 4 a 6 minutos después de verter el pegamento. Si la polimerización no es buena, se deben usar altas concentraciones de TEMED y persulfato de amonio.

(3) Una vez preparado el pegamento, se puede rellenar la placa de pegamento. Generalmente, el gel se vierte lentamente en la ranura de la placa de vidrio a lo largo del borde de la capa. Después del vertido, se deja estacionario para permitir la polimerización completa.

Nota

① Cuando utilice abrazaderas para fijar la placa de vidrio, es mejor utilizar una fuerza de sujeción ligeramente mayor para evitar fugas de pegamento durante el proceso de llenado de pegamento debido a una fuerza insuficiente.

② Durante el proceso de vertido del gel, tenga cuidado de no generar burbujas de aire, de lo contrario los resultados de la secuenciación se verán afectados.

IV. Electroforesis

1. Pre-electroforesis

(1) Cuando se complete la polimerización del gel, saque el peine de dientes de tiburón y déle la vuelta. Inserte el extremo dentado en el gel para formar un pocillo de muestra.

(2) Fije inmediatamente la placa de gel en el tanque de gel de secuenciación. Generalmente, los tanques superior e inferior del tanque de gel de secuenciación están separados, por lo que el tampón TBE solo se puede agregar después de fijar la placa de gel. .

(3) Diluya el tampón 10×TBE a 1×TBE, agregue el tampón en los tanques de electroforesis superior e inferior, elimine las burbujas generadas y conecte la fuente de alimentación para prepararse para la preelectroforesis.

(4) Algunos tanques de electroforesis, como el Macrophor de LKB, se calientan mediante un baño de agua. El baño de agua debe calentarse a 55 °C antes de la electroforesis. Algunos no utilizan calentamiento por baño de agua y dependen del calor generado durante el proceso de electroforesis para el aislamiento, como el tanque de electroforesis de secuenciación producido por Shanghai Qiujing Plexiglas Instruments. Este tanque debe intercalarse con dos placas de aluminio que disipan el calor para aumentar la temperatura. de toda la placa de gel consistente.

(5) Preelectroforesis a un voltaje de 30 V/cm durante 20 a 30 minutos. El proceso de preelectroforesis consiste en eliminar los iones de impureza del gel y al mismo tiempo permitir que la placa de gel alcance la temperatura requerida. La electroforesis a alta temperatura puede prevenir la formación de estructuras en forma de horquilla en regiones ricas en GC, lo que afectará los resultados de la secuenciación.

Nota

① Cuando utilice un peine con dientes de tiburón para hacer el orificio de muestreo, tenga cuidado de insertar la punta del diente en el pegamento aproximadamente 0,5 mm. Tenga cuidado de no causar. El orificio de muestreo tiene fugas; de lo contrario, no se pueden obtener resultados correctos.

② Siempre preste atención a si el tampón en el tanque de electroforesis de arriba tiene fugas; de lo contrario, fácilmente causará un cortocircuito y dañará el instrumento de electroforesis.

2. Preparación de la muestra

La preparación de la muestra se puede realizar durante la preelectroforesis. Calentar la muestra reaccionada en un baño de agua hirviendo durante 1 a 3 minutos y colocarla inmediatamente. Sólo servir. hielo. Si la muestra no se utiliza durante un largo tiempo, se debe reprocesar. Se puede utilizar gel de poliacrilamida al 4-6%, con un espesor de gel de 0,4 mm. Un espesor del pegamento inferior a 0,4 mm puede provocar que la señal sea demasiado débil. No es necesario absorber el aceite mineral que cubre la capa superior al agregar la muestra, pero absorba con cuidado la muestra azul debajo del aceite mineral.

3. Carga de muestra y electroforesis

Apague el instrumento de electroforesis, use una pipeta para aspirar la solución tampón para limpiar bien la muestra, elimine la urea que se difundió durante la preelectroforesis y luego use inmediatamente un tubo capilar para inyectar. El muestreador absorbe la muestra y la agrega al orificio de muestra. El orden de carga es generalmente G, A, T, C. Después de agregar la muestra, se realiza inmediatamente la electroforesis. La electroforesis se puede realizar a 30 V/cm al principio y se puede aumentar a 40-60 V/cm después de 5 minutos, manteniendo un voltaje constante. En términos generales, una placa de gel de 55 cm de largo y 0,2 mm de espesor se puede someter a electroforesis a un voltaje constante de 2500 V durante 2 horas para llegar al fondo. Al mismo tiempo, durante el proceso de electroforesis, la corriente se puede reducir constantemente desde 28 mA. a 25 mA. Para leer secuencias más largas, se pueden utilizar dos o más rondas de carga.

Nota

① Al cargar muestras para electroforesis, asegúrese de prestar atención a si la temperatura de la placa de gel alcanza aproximadamente los 55 °C. Si no la ha alcanzado, debería hacerlo. Espere hasta que la temperatura alcance los 55 °C antes de cargar las muestras para la electroforesis.

② En términos generales, no es aconsejable utilizar un voltaje demasiado alto durante la electroforesis, porque un voltaje demasiado alto reducirá la resolución del gel y hará que las bandas se difundan. Durante la electroforesis se puede realizar una electroforesis de potencia constante.

5. Tinción con plata del gel secuenciador.

El proceso de tinción requiere sumergir el gel en un recipiente de plástico. Por lo tanto, utilice al menos dos platos, de tamaño similar a los platos de vidrio.

Lave el plato con agua de alta calidad antes de agregarle una solución nueva.

1. Después de la electroforesis, utilice una pieza de plástico para separar con cuidado las dos placas. El gel debe quedar firmemente adherido a la placa de vidrio corta.

2. Fijar el gel: Coloque el gel (incluida la placa de vidrio) en un recipiente de plástico, sumérjalo en la solución fijadora/parada y agítelo bien durante 20 minutos o hasta que el tinte esté en la muestra. desaparece por completo. El gel se puede colocar en la solución fix/stop y dejarla toda la noche (sin agitar). Reserve la solución fix/stop para terminar la reacción de desarrollo.

3. Lavar el gel: Utiliza agua ultrapura para agitar y lavar el gel 3 veces, 2 minutos cada vez. Sáquelo del agua y, cuando lo transfiera a la siguiente solución, mantenga quieto el borde de la placa de goma durante 10 a 20 segundos para permitir que se escurra el agua.

4. Tinción en gel: Pasar el gel a la solución de tinción y agitar bien durante 30 minutos.

5. Desarrollo en gel

(1) Agregue formaldehído (3 ml) y solución de tiosulfato de sodio (400 μl) a la solución de desarrollo para completar la preparación de la solución de desarrollo.

(2) Saque el gel de la solución colorante y colóquelo en un recipiente lleno de agua ultrapura durante 5 a 10 segundos. Tenga en cuenta que el tiempo total para transferir el gel del agua ultrapura a la solución de desarrollo no debe ser superior a 5 a 10 segundos. Si el tiempo de remojo es demasiado largo, la señal será débil o se perderá. Si el tiempo de remojo es demasiado largo, repita el paso 5 y sumérjalo en una solución de tinte.

(3) Transfiera inmediatamente el gel a 1 litro (la mitad del volumen total) de solución reveladora preenfriada y agite bien hasta que comiencen a aparecer las bandas de la plantilla o comience a aparecer el primer lote de bandas. Mueva el gel al resto de la solución de desarrollo. Continúe desarrollando en 1 litro de solución de revelado durante 2 a 3 minutos o hasta que aparezcan todas las bandas.

6. Gel fijador: Añade un volumen igual de solución fijadora/parada directamente al revelador. Detenga la reacción de desarrollo y fije el gel.

7. Remoje el gel dos veces en agua ultrapura durante 2 minutos cada vez. Tenga cuidado de sujetar el borde de la placa de goma con guantes durante esta operación para evitar huellas dactilares en el pegamento.

8. Secar el gel a temperatura ambiente o utilizar calefacción por escape. Observe el gel en una caja de luz visible o sobre un fondo amarillo blanco brillante (como papel). Si se requieren registros permanentes, se puede usar una película EDF para preservar los resultados experimentales.

Nota

La tinción con plata de productos de secuenciación es un nuevo método para mostrar información de secuencia. El éxito o el fracaso de este sistema se ve afectado por varios factores.

① Agua. La calidad es extremadamente importante para el éxito del teñido. El agua ultrapura (agua de NANOpureR o Milli-QR) o agua bidestilada dará mejores resultados. Si hay impurezas en el agua, es posible que no aparezcan bandas de bajo peso molecular.

② El carbonato de sodio también es muy importante. Es mejor utilizar carbonato de sodio fresco de grado de la American Chemical Society, como carbonato de sodio de grado reactivo de Fisher y Kodak ACS (Fisher Cat #S263-500 o S262-3, o Kodak Cat #109-1990), que generalmente da mejores resultados. .

③ El paso de lavado después de la coloración es muy crítico. Si el gel se lava durante demasiado tiempo, las partículas de plata se desprenderán del ADN, produciendo poca o ninguna señal de secuencia. Si el tiempo de lavado es demasiado largo, se puede repetir el paso de teñido.

④ Si el espesor del gel supera los 0,4 mm o la concentración de acrilamida es superior al 4 al 6%, es necesario ampliar el tiempo de fijación y tinción. Si el gel tiene un espesor inferior a 0,4 mm, el lavado después de la reacción de tinción debe acortarse a no más de 5 segundos.

⑤ Realizar todos los pasos a temperatura ambiente, excepto la reacción de desarrollo. La solución de revelado debe enfriarse previamente a 10-12°C para reducir el ruido de fondo. Nota: Agregue formaldehído y tiosulfato de sodio a la solución de revelado antes de usar. Utilice soluciones nuevas de tinción y revelado. No reutilice ninguna solución.

6. Revelado de película EDF

El uso de película EDF puede mejorar el contraste de las bandas de secuenciación. Si las bandas del gel de secuenciación son muy claras, recomendamos transferir los datos a la película EDF. y el pegamento con tinción de plata mejora la legibilidad de la banda después de que su imagen se transfiere a la película EDF.

1. En un cuarto oscuro, coloque el gel teñido adherido a la placa de vidrio (con el pegamento hacia arriba) sobre la caja de luz fluorescente. Si hay una placa de difusión adecuada, también puede utilizar una caja de luz blanca para garantizar el tiempo de exposición, utilice una pequeña tira de película EDF para exponer en diferentes momentos y comprobar diferentes intensidades de exposición. Generalmente, se pueden obtener buenos resultados exponiendo. durante 20 a 40 segundos.

2. Busque la esquina con muescas de la película EDF debajo de la luz roja y luego coloque la película sobre el gel de modo que la muesca quede en la esquina superior izquierda.

Dado que la película EDF es de una sola cara, debes asegurarte de que la muesca esté en la esquina superior izquierda.

3. Coloque una placa de vidrio limpia y seca sobre la película EDF y encienda la caja de luz durante unos 20 segundos.

4. Para revelar película EDF manualmente siguiendo los pasos para revelar película autorradiográfica, puede utilizar los siguientes procedimientos:

(1) Revelar en revelador Kodak GBX durante 1 a 5 minutos;

(2) Lavar con agua durante 1 minuto;

(3) Fijar en fijador Kodak GBX durante 3 minutos;

(4) Lavar con agua durante 1 minuto.

Nota

① El gel debe estar completamente seco antes del revelado de la película EDF. Utilice guantes para evitar huellas dactilares. Tenga en cuenta también que la película EDF no se puede utilizar con procesadores de película automáticos.

② El tiempo de exposición óptimo puede ser diferente para diferentes fuentes de luz. Seleccione el tiempo de exposición óptimo para la fuente de luz que está utilizando exponiendo una pequeña tira de película EDF para diferentes tiempos. .

③ Un tiempo de exposición corto hará que la imagen de la película EDF sea más oscura, mientras que un tiempo de exposición más largo ayudará a debilitar el fondo. El "método de escopeta" es un método para extraer genes diana de genomas biológicos. Primero, se utilizan métodos físicos (como fuerza de corte, ultrasonido, etc.) o métodos químicos enzimáticos (como endonucleasas de restricción) para cortar el ADN cromosómico de las células biológicas en muchos fragmentos a nivel genético, y luego estos fragmentos se combinan con portadores apropiados. El ADN recombinante se transfiere a la bacteria receptora para su amplificación y se obtiene una biblioteca de genes propagados clonalmente. Luego, combinado con el método de detección, se selecciona la cepa que contiene un determinado gen entre numerosas cepas transformantes y se selecciona el ADN recombinante. aislado y recuperado.

Este método consiste en utilizar tecnología de ingeniería genética para aislar el gen objetivo. Su característica es evitar la dificultad de aislar directamente el gen y descartar el gen objetivo en la biblioteca de ADN genómico. Se puede decir que se trata de utilizar el principio de "disparo disperso" para "alcanzar" un determinado gen. Dado que los genes objetivo son muy pocos y demasiado pequeños en todo el genoma, depende en gran medida de la "suerte", por lo que la gente llama a este método el "método de escopeta" o método experimental de "escopeta".

1. Utilice enzimas de restricción para cortar el fragmento grande del fragmento objetivo InsertDNA y utilice electroforesis en gel de agarosa para recuperarlo.

2. Utilice métodos físicos (como ultrasonido, etc.) para cortar los grandes fragmentos de ADN recuperados y luego utilice la ADN polimerasa T4 para suavizar los extremos de los pequeños fragmentos de ADN.

3. Realizar electroforesis en agarosa y cortar el gel para recuperar pequeños fragmentos de ADN de 1kpb a 2kpb. Luego use BcaBestDNA Polymerase para agregar una base A al extremo 3' del ADN.

4. Conecte el fragmento de ADN de cola A en T-Vector, luego transforme y seleccione clones.

5. Realice la secuenciación de ADN en clones positivos (que contienen un inserto de 1 kbp~2 kbp).

6. Edite los datos y finalmente conéctelos en un gran fragmento de secuencia de ADN.