Conceptos básicos de la metilación de 450k (1)
La metilación del ADN es la modificación más común en epigenética. Sus principales formas incluyen: 5-metilcitosina (5-mC) y una pequeña cantidad de N6-metiladenina (N6-mA) y 7-metilguanina (7. -mg).
Actualmente, la metilación del ADN se refiere comúnmente a la metilación de la isla CpG, es decir, bajo la acción de las ADN metiltransferasas (DNMT), la citosina en el extremo 5' del dinucleótido CpG se convierte en 5'metilcitosina.
La metilación del ADN citosina en células somáticas de mamíferos ocurre principalmente en islas CpG.
Islas CpG: se refiere a una densidad de secuencia CpG particularmente alta en comparación con todo el genoma. La región enriquecida generalmente se encuentra cerca. el promotor, la región 5' no traducida o el primer exón; generalmente, la longitud de la secuencia de islas CpG es superior a 500 pb, el contenido de GC es superior al 55% y la tasa de aparición de CpG es superior a 0,65, 40%. La región promotora contiene islas CpG. .
Las costas CpG se refieren a la región a 2 kb del borde de la isla CpG
Las luminarias CpG se refieren a la región a 4 kb del borde de la isla CpG
No CpG grupos metilo en mamíferos La metilación ocurre principalmente en la etapa de desarrollo embrionario y en el tejido cerebral.
60%-90% de los CpG en el genoma están metilados y los CpG no metilados forman islas CpG, ubicadas en el promotor de genes estructurales. Secuencia central y punto de inicio de la transcripción
En términos generales, la función principal de la metilación del ADN es regular la expresión génica, es decir, cuanto mayor sea el nivel de metilación de la isla CpG en la región promotora del gen, mayor será el nivel de expresión génica correspondiente. Es relativamente menor; la metilación del ADN está regulada por metilasas (como DNMT3A) y desmetilasas (TET2).
Además de los cambios en el nivel de metilación de las islas CpG que pueden provocar la aparición de tumores, la metilación anormal de las costas y accesorios de CpG también puede provocar la supresión de los niveles de transcripción genética.
A El principio del chip base se basa en la detección de señales de la hibridación de la secuencia de ADN después del tratamiento con sulfito que cambia la citosina no metilada en uracilo, mientras que la citosina metilada permanece sin cambios. Luego, el uracilo se convierte en timina y finalmente se realiza la hibridación del chip; /p>
El chip 450K de Illumina utiliza dos ensayos: Infinium I e Infinium II. El primero tiene dos perlas (microperlas), a saber, una M metilada y una U no metilada, la segunda es una perla (no distingue entre metilada y no metilada). ).
Y en la imagen de abajo, nota: la columna de la izquierda es el locus de GpC no metilado, la columna de la derecha es el locus de GpC metilado, la parte superior e inferior son Infinium I e Infinium Ⅱ respectivamente.
Explorar Las agujas se basan en sitios de metilación y cada sonda detecta un sitio de metilación. Para poder distinguir los sitios metilados de los no metilados, existen dos tipos de sondas en 450K y 850K, llamadas sondas de tipo I y sondas de tipo II.
Para humanos en términos generales, la corriente principal actual Los chips de metilación del ADN incluyen 450K y 850K, ambos desarrollados por Illumina. Los 450K y 850K aquí se refieren a la cantidad de sondas en el chip, correspondientes a la cantidad de sitios de metilación que se pueden detectar.
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Para el ADN tratado con bisulfito, el C no metilado cambiará a T, mientras que el C metilado no cambiará.
Para las sondas de tipo I, existen dos secuencias, el término técnico se denomina tipo perla, entre las cuales el tipo perla no metilada se utiliza para hibridar con C no metilado, y el tipo perla metilado se utiliza con hibridación con C metilado. .
Para los humanos, existen dos chips de metilación de ADN convencionales: 450K y 850K. Estos dos números representan el número de sitios de metilación cubiertos y son una aproximación;
p>El chip de metilación utiliza. una mezcla de sondas de tipo I y sondas de tipo II. La sonda de tipo I reconoce el C metilado y el C no metilado a través de dos tipos de cuentas respectivamente. La sonda de tipo II reconoce el C metilado y el C no metilado respectivamente. La aguja puede distinguir el C metilado del C no metilado. un tipo de cuenta.
1. Introducción a Illumina HumanMmethylation450 BeadChip (chip 450k metilado)
Los gráficos y principios del chip 450K se pueden mostrar en la siguiente figura
1 Chip: un chip incluye 12 matrices (como se muestra en la imagen), es decir, un chip puede producir 12 muestras y una máquina puede ejecutar 8 chips a la vez, lo que significa un total de 96 muestras, y cada muestra puede ser. midió información de metilación para más de 450.000 sitios CpG (aproximadamente el 1% de todos los humanos, pero cubriendo la mayoría de las islas CpG y regiones promotoras), y el chip en sí contiene algunas sondas de control para el control de calidad.
2. Principio: En definitiva, detección de señales basada en la hibridación de secuencias de ADN tratadas con sulfito. El sulfito es el "estándar de oro" para la detección de metilación, ya sea mediante chip o secuenciación de metilación, las muestras de ADN deben tratarse primero con sulfito para convertir el C no metilado en U, y el C metilado permanece sin cambios y puede distinguirse después de la secuenciación o hibridación posterior. 450K usa dos sondas para medir la metilación. Infinium I usa dos perlas (M metilada y U no metilada, como se muestra en la figura), mientras que II tiene solo una perla (es decir, metilada y no metilada juntas), lo que también conduce a sus dos sondas. diferencias en la detección de fluorescencia posterior. 450K utiliza dos señales de detección de fluorescencia (luz roja y luz verde).
2. Cuestiones que deben considerarse en el análisis
1. Corrección de fondo
2. Corrección de luz roja y luz verde
3. Uso de chips de control (la propia Illumina450K tiene algunos chips de control que se pueden usar para el control de calidad, como la eficiencia del tratamiento con sulfito)
4. Calibración de los tipos de sonda (tipo I y tipo II) ( diferentes sondas Los datos generados por el tipo de aguja son diferentes)
Al final, elegimos el método BMIQ (estirar el nivel de metilación de la sonda tipo II al nivel tipo I según el principio de eBay) para la corrección.
5. Corrección de posición (los datos generados en diferentes ubicaciones del chip pueden estar sesgados)
6. Corrección por lotes (los datos producidos en diferentes lotes pueden estar sesgados) )
7. ¿Es confiable la secuencia de la sonda? (Algunas sondas están ubicadas en la región repetida o contienen SNP, etc., lo que afectará la hibridación y los resultados finales. Deben eliminarse. Se adjunta un documento de referencia con una lista en el interior Se utiliza para eliminar sondas defectuosas)
Promedio β = señal B / (señal A + señal B + 100)
Calculando metilado (señal A) y no metilado La relación de intensidad entre. Se utilizaron alelos de metilación (señal B) para determinar el nivel de metilación del ADN (valor β).
En concreto, el valor β se calcula a partir de la intensidad de los alelos metilados (M corresponde a la señal A) y no metilados (U corresponde a la señal B), y la relación de señales fluorescentes β = Max(M,0 )/[Máx(M,0)+Máx(U,0)+100].
Por lo tanto, los valores de β varían de 0 (completamente no metilado) a 1 (completamente metilado)
El significado específico de los valores de β es:
Cualquier valor beta igual o superior a 0,6 se considera completamente metilado.
Cualquier valor beta igual o inferior a 0,2 se considera completamente desmetilado.
Los valores de beta entre 0,2 y 0,6 se consideran parcialmente metilados.
Referencia:
/thread-237-1-1.html
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