14. Secuenciación de capturas
El principio de captura por hibridación es capturar el fragmento diana a través de una sonda diseñada artificialmente que es parcial o completamente complementaria al fragmento diana. Los fragmentos sin el fragmento de sonda diseñado se eluirán y descartarán, y luego las sondas. se separan por desnaturalización y se capturan fragmentos para construir una biblioteca de secuenciación de segunda generación.
Según el diferente estado de la sonda, la captura por hibridación se puede dividir en hibridación en fase sólida e hibridación en fase líquida. La hibridación en fase sólida cubre el chip con sondas y las sondas capturan los fragmentos diana. La hibridación en fase líquida implica colocar una sonda en una fase líquida y la sonda transporta biotina. Una vez completada la hibridación, la sonda puede ser adsorbida por perlas magnéticas (en este momento, la sonda tiene sondas vacías que llevan el fragmento objetivo) y luego descartar los fragmentos no capturados y luego separar la sonda y el fragmento objetivo mediante desnaturalización, y luego todas las sondas vacías son magnéticamente. Las perlas se adsorben y se descartan, y la captura se completa.
La mayor ventaja de la captura híbrida es que el segmento de captura es grande y puede alcanzar cientos de MB al mismo tiempo. Según el principio de la sonda, su uniformidad es muy buena (la uniformidad es una; parámetro clave para evaluar la tecnología de captura, uniformidad (se reducirá el coste de la secuenciación posterior). La desventaja de la captura por hibridación es que tiene poca especificidad y es fácil capturar fragmentos no objetivo, porque la muestra se interrumpirá aleatoriamente antes de la hibridación (generalmente 500 pb es una longitud adecuada) y la sonda puede hibridarse parcialmente con el fragmento objetivo durante captura, lo que resulta en la captura de algunos fragmentos que contienen parte del fragmento objetivo, lo que resulta en una disminución de la especificidad.
La ventaja de MIP es que tiene buena especificidad y puede construir directamente fragmentos capturados. Sin embargo, la desventaja es que la eficiencia de captura no es alta y es difícil diseñar sondas para capturar ciertos fragmentos.
La tecnología de secuenciación por captura de objetivos por PCR múltiple utiliza múltiples reacciones de PCR para amplificar simultáneamente múltiples secuencias de regiones objetivo para obtener productos de amplicón, luego, a través de reacciones de PCR o reacciones de ligación enzimática, se introducen las secuencias adaptadoras necesarias para la secuenciación de segunda generación; en ambos lados del producto amplicón para obtener una biblioteca de amplicones, finalmente se realiza la secuenciación de segunda generación;
Debido a que el diseño de los cebadores y el precio del sistema son los más simples, el umbral de diseño es bajo y no se requiere un diseño experimental especial, la captura de fragmentos objetivo por PCR es también el método de comercialización más utilizado. .
————El manuscrito ha sido revisado recientemente y tengo que ir a trabajar durante el día, por lo que el manuscrito ya no existe. También quiero ver si puedo solicitar un doctorado. No sé dónde puedo obtener un doctorado. ¡Intenta asegurar la finalización del turno de día!