Puntos clave para el cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana HUVEC
En 1984, Hiroyoshi Hoshi y Wallace L. Mckeehan obtuvieron y establecieron la línea celular HUVEC a partir de una sección de la vena del cordón umbilical humano normal de unos 10-20 cm de largo.
SetsukoShioda et al. encontraron que el tiempo de duplicación de las líneas celulares HUVEC en los pases 18-30 fue de 23,5 horas, el tiempo de duplicación en los pases 24-27 fue de 67 horas y el tiempo de duplicación en los pases 27-30. fue de 84 horas, el tiempo de duplicación de las generaciones 32-34 es de 100 horas. Después de cultivar durante 40 generaciones, la morfología celular se diversificó, algunas células se hicieron más grandes o más pequeñas y algunas aparecieron multinucleadas, la densidad celular disminuyó y el tiempo de duplicación se prolongó. Finalmente, las células dejaron de crecer en el pase 54 y la esperanza de vida de ATCC también se mostró en el pase 50-60.
En 2018, Setsuko Shioda y otros descubrieron que había espacios entre las células cuando la línea celular HUVEC (pasaje 31) se adhería a la pared y se volvía confluente, lo que era diferente de las características típicas de las células endoteliales.
Agite rápidamente el tubo de criopreservación que contiene 1 ml de suspensión celular en un baño de agua a 37 °C para descongelarlo, agregue 4 ml de medio y mezcle uniformemente. Centrifugar a 1000 RPM durante 4 minutos, desechar el sobrenadante, agregar 1-2 ml de medio y soplar uniformemente. Luego agregue toda la suspensión celular a la botella de cultivo y cultive durante la noche (o agregue la suspensión celular a un recipiente de 10 cm, agregue aproximadamente 8 ml de medio de cultivo y cultive durante la noche). Cambie el medio y verifique la densidad celular al día siguiente.
Crioconservación celular
Condiciones de criopreservación
60% medio básico + 30% FBS + 10% DMSO, almacenamiento en nitrógeno líquido
Recomendar Starfish HyCyte? Solución de criopreservación en un solo paso (lista para usar, sin suero, sin necesidad de enfriamiento programado)
1. Una vez que las células han crecido hasta una densidad que se puede pasar, están listas para ser utilizadas. criopreservación.
2. Digerir las células y tomar una pequeña cantidad de suspensión celular para contarlas. La suspensión celular se centrifugó a 250 g durante 4 min.
3. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en una cantidad adecuada de solución de criopreservación preenfriada a 4°C. Alícuotas de células en crioviales según proporción o cantidad. La densidad de congelación general es (1,0~2,0)×106 células/ml.
Nota: Colocar las células en condiciones de no cultivo durante un tiempo prolongado afectará gravemente al estado de las células. Si se resuspenden en una solución de criopreservación después de la centrifugación para contar, coloque las células en un refrigerador a 4 °C para debilitar el metabolismo celular y mantener mejor el estado celular.
4. Si utiliza la solución de criopreservación de un solo paso Starfish, coloque el tubo de criopreservación directamente en el refrigerador de -80°C verticalmente para completar la criopreservación de "un solo paso". Si se utiliza una solución de criopreservación programada, el tubo de criopreservación debe colocarse en una caja de enfriamiento programada previamente enfriada y luego colocarse en un refrigerador de -80 °C.
5. Después de 24 horas, los crioviales se pueden transferir a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
Nota: Las células no se pueden almacenar en un frigorífico a -80°C durante mucho tiempo. Se recomienda pasar a nitrógeno líquido lo antes posible después de 24 horas.
Medio: Medio basal de cultivo de células endoteliales + 5% FBS + 1% de aditivo de cultivo de células endoteliales + 1% P/S
Proporción de pases recomendada: 1:3-1:4, cada uno Cambie el medio una vez cada 2-3 días
Condiciones de cultivo: Fase gaseosa: 95% aire + 5% CO?, temperatura: 37°C
Una vez que la densidad celular alcance 80 %-90%, es suficiente Realizar subcultivo.
1. Precalentar el medio de cultivo completo, tripsina y PBS.
2. Desechar el sobrenadante del cultivo y enjuagar las células 1-2 veces con PBS sin iones calcio y magnesio.
3. Agregue 2 ml de solución de digestión (tripsina al 0,25 %-EDTA 0,53 mM número de catálogo: GUTP-R001) al frasco de cultivo y colóquelo en una incubadora a 37 °C para la digestión durante 1 a 2 minutos. y luego obsérvelo bajo un microscopio. En el caso de la digestión celular, si la mayoría de las células se vuelven redondas y se caen, llévelo rápidamente al banco de trabajo, golpee la botella de cultivo varias veces y luego agregue una pequeña cantidad de cultivo. Medio para detener la digestión.
4. Añadir 6-8ml de medio de cultivo por botella, mezclar suavemente y aspirar, centrifugar a 1000RPM durante 4 minutos, descartar el sobrenadante, añadir 1-2mL de medio de cultivo y soplar uniformemente.
5. Dividir la suspensión celular en nuevos platos o frascos que contengan 8 ml de medio de cultivo en una proporción de 1:2 a 1:4.
1. Esta célula es una línea celular de pase limitado y puede cultivarse in vitro durante 20 generaciones. Preste atención al control de generación.
2. Es difícil cultivar esta célula, por lo que se recomienda utilizar un medio de cultivo especial.
3. Sistema de cultivo endotelial de vena umbilical humana inmortalizada: Medio basal de células endoteliales + 5% FBS + 1% aditivo de cultivo de células endoteliales + 1% P/S.
Se recomienda utilizar medio de cultivo completo de células endoteliales de vena umbilical humana Starfish, número de producto: TCH-G406.
4. Si opta por utilizar otras marcas de medios de cultivo, puede elegir:
(1) Medio de cultivo basal de células endoteliales recomendado: ScienCell (Cat. No. 1001)
Introducción a los ingredientes básicos: el sistema de cultivo endotelial de la vena umbilical humana inmortalizada es un medio completo especialmente diseñado para el cultivo in vitro de células endoteliales vasculares y es el más adecuado para su crecimiento. Contiene aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, compuestos orgánicos e inorgánicos, hormonas, factores de crecimiento, oligoelementos y suero fetal bovino en baja concentración (5%). La fórmula de este medio puede promover selectivamente la proliferación y el crecimiento de células endoteliales vasculares normales en cultivo in vitro y lograr el equilibrio nutricional óptimo para ellas.
(2) Suero bovino fetal recomendado: HyCyte? Suero bovino fetal preseleccionado con células madre (Cat.No.FBP-S001)
Introducción a los ingredientes básicos: Adecuado para pacientes con Células con mayores requisitos y células más difíciles de obtener, como las células endoteliales vasculares.
(3) Aditivo de cultivo de células endoteliales recomendado: ScienCell (Cat.No.SC1052)
Introducción del ingrediente básico: el aditivo de cultivo de células endoteliales (ECGS) es un producto extraído de la glándula pituitaria bovina Suplemento medio que contiene factores de crecimiento, hormonas y proteínas necesarias para el cultivo de células endoteliales vasculares. Este suplemento maximiza el crecimiento de las células endoteliales de la vena umbilical humana inmortalizadas (HUVEC), y la adición de este factor es fundamental para mantener la morfología de las células endoteliales de la vena umbilical humana inmortalizadas (HUVEC).
(1) Asegúrese de utilizar los dos sistemas de cultivo recomendados anteriormente para cultivar células endoteliales de la vena umbilical humana inmortalizadas (HUVEC); de lo contrario, es posible que las células no puedan proliferar.
(2) Las células de la botella T25 secretarán una pequeña cantidad de pequeños puntos negros debido al impacto del proceso de transporte. Esto no es un problema de contaminación y es un fenómeno normal. Los puntos negros disminuirán gradualmente. ser cultivado en un sistema de cultivo especial.
(3) Las células endoteliales de la vena umbilical humana inmortalizadas (HUVEC) tienen altos requisitos de calidad del suero. Utilice suero bovino fetal de alta calidad para el cultivo. Si el estado celular no es bueno, se recomienda aumentar la concentración de suero fetal bovino al 10%.