¿Cuáles son las razones de la tinción de fondo más oscura en los experimentos de inmunohistoquímica?
1) La concentración de anticuerpos es demasiado alta: Una de las razones más comunes es que la concentración de anticuerpos primarios es demasiado alta. La solución es que cada vez que se utiliza un nuevo anticuerpo, se debe probar su concentración de trabajo para individualizar cada anticuerpo y encontrar la concentración de trabajo ideal adecuada para su propio laboratorio. Esto debería ser cierto incluso para los anticuerpos listos para usar. simplemente sigue las instrucciones para teñir.
(2) El tiempo de incubación del anticuerpo es demasiado largo o la temperatura es alta: la solución es implementar estrictamente los procedimientos operativos. Es mejor llevar consigo un reloj para recordarlo a tiempo. para evitar prórrogas de tiempo por olvido. El popular método de dos pasos (polímero) es muy sensible y requiere que el tiempo de incubación del anticuerpo primario no sea el tradicional de 1 hora, sino de 30 minutos. Por lo tanto, debe ajustarse de acuerdo con los resultados de la tinción.
(3) El DAB se deteriora y tarda demasiado en desarrollar color: Es mejor utilizar DAB recién preparado. Si queda algún sedimento conviene filtrarlo antes de su uso. El DAB preparado no debe almacenarse por mucho tiempo, porque en ausencia de enzimas, el peróxido de hidrógeno también liberará átomos de oxígeno para reaccionar con el DAB y reducir la eficacia del DAB no utilizado. Debe almacenarse en el refrigerador durante unos días. No es aconsejable volver a utilizar este método aparentemente económico. El desarrollo del color de DAB se controla mejor bajo un microscopio y la reacción finaliza inmediatamente cuando se alcanza el grado de tinción deseado. Sin embargo, esto parece poco realista cuando hay demasiados portaobjetos teñidos o cuando se utiliza una máquina de tinción. Sin embargo, se deben controlar al menos algunos anticuerpos nuevos o raramente usados al desarrollar colores para evitar un tiempo de revelado excesivo.
(4) Secado del tejido: no reponer el líquido de reparación a tiempo después de que la solución de reparación se desborda, teñir demasiadas secciones, moverse demasiado lento, olvidarse de gotear y perder gotas son todas causas del secado del tejido. . La solución es operar con cuidado y utilizar una pluma DAKO o una pluma PAP para dibujar círculos alrededor del tejido, lo que puede evitar eficazmente la pérdida de líquido y aumentar la velocidad de operación.
(5) Las rodajas se sumergen en tampón o solución reparadora durante demasiado tiempo (más de 24 horas): la causa no está clara, pero el fenómeno existe. A algunos laboratorios les gusta desparafinar las secciones hasta que se reparan el día anterior y agregar anticuerpos para la tinción inmunohistoquímica al día siguiente. Si el recipiente que contiene las secciones y la solución reparadora se coloca en un refrigerador a 4°C durante la noche, no habrá ningún impacto significativo. sobre los resultados, si se deja a temperatura ambiente, especialmente en verano, se producirá una coloración de fondo, así que no lo guarde por mucho tiempo.
(6) Anticuerpos policlonales con anticuerpos primarios deteriorados y de mala calidad: preste atención al período de validez del anticuerpo. Los anticuerpos caducados no desarrollarán color o tendrán un fondo coloreado. Cuando se utilizan anticuerpos recién adquiridos, es mejor configurar un control positivo y utilizar anticuerpos usados para comparar.