¿Cuál es la diferencia entre inmunohistoquímica y Westernblot?

1. Principios diferentes:

La inmunohistoquímica utiliza la unión entre anticuerpos y antígenos para tener un alto grado de especificidad. Primero, se extrae una determinada sustancia química de los tejidos o células y se utiliza como antígeno o hapteno. Se obtienen anticuerpos específicos inmunizando animales y luego los anticuerpos se utilizan para detectar sustancias antigénicas similares en tejidos o células.

Westernblot también utiliza la unión entre anticuerpos y antígenos para tener una alta especificidad. La muestra de proteína separada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida se transfiere a un portador de fase sólida. El portador de fase sólida adsorbe la proteína en forma de enlaces no valentes y puede mantener sin cambios el tipo de polipéptido separado por electroforesis y su actividad biológica. La proteína o polipéptido del vehículo en fase sólida se utiliza como antígeno, reacciona con el anticuerpo correspondiente y luego reacciona con la enzima o el segundo anticuerpo marcado con isótopos.

2. Localización tisular diferente:

La inmunohistoquímica es más precisa en la localización tisular y en aspectos cualitativos, pero no lo suficientemente precisa cuantitativamente. Debido a que Westernblot tiene una calibración de referencia interna, es más preciso en la cuantificación, pero no es tan bueno como la inmunohistoquímica en la localización de tejidos.

Información ampliada:

1. Pasos operativos de inmunohistoquímica (método SP):

1. Las secciones se desparafinan rutinariamente con agua. Si se requiere la recuperación del antígeno, se puede realizar después de este paso.

2. Lavar con solución tampón durante 3 minutos/2 veces.

3. Para reducir la tinción de fondo no específica causada por la peroxidasa endógena, incube las secciones en HydrogenPeroxideBlock durante 10-15 minutos.

4. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

5. Agregue UltraVBlock gota a gota e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para bloquear la tinción de fondo no específica.

6. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

7. Añadir gota a gota la solución de trabajo del anticuerpo primario e incubar a 37°C durante 1-2 horas.

8. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

9. Añadir PrimaryAntibodyEnhancer (potenciador) gota a gota e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

10. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

11. Añadir gota a gota el polímero HRP (anticuerpo secundario marcado con enzima) e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

12. Lavar con solución tampón durante 5 minutos/2 veces.

13. Añade 1-2 gotas de DABPlusChromogen (o AECPlusChromogen) a 1ml de DABPlusSubstrate (o AECPlusSubstrate), mezcla bien, añade gota a gota a la rodaja e incuba durante 3-15 minutos.

14. Enjuagar completamente con agua del grifo, contrateñir, deshidratar, aclarar y sellar.

2. Pasos de la operación Westernblot:

1. Reactivo SDS-PAGE: ver experimento de electroforesis.

2. Tampón de homogeneización: 1,0 MTris-HCl (pH 6,8) 1,0 ml; 10% SDS 6,0 ml; β-mercaptoetanol 0,2 ml;

3. Tampón de transferencia: 2,9 g de glicina; 5,8 g de Tris; 0,37 g de SDS; agregar ddH2O para ajustar el volumen a 1000 ml.

4. 0,01 MPBS (pH 7,4): NaCl 8,0 g; KCl 0,2 g; Na2HPO 41,44 g; añadir ddH2O a 1000 ml.

5. Solución de tinción de membrana: azul brillante de Coomassie 0,2 g; metanol 80 ml; ácido acético ddH2O118 ml; Solución de recubrimiento (5% de leche desnatada en polvo, recién preparada): 1,0 g de leche desnatada en polvo disuelta en 20 ml de 0,01 MPBS.

6. Solución cromogénica: DAB 6,0 mg; 0,01 MPBS 10,0 ml; sulfato de níquel amina 0,1 ml;