¿Qué es la fertilización in vitro?
La Fertilización In Vitro o (fertilización externa) se refiere a la tecnología en la que los espermatozoides y óvulos de mamíferos completan el proceso de fertilización en un ambiente controlado artificialmente fuera del cuerpo. Se le conoce como FIV en inglés. Debido a que es inseparable de la tecnología de transferencia de embriones (TE), también se la conoce como FIV-ET. En biología, los animales obtenidos después de la fertilización in vitro con embriones trasplantados al cuerpo de la madre se denominan animales de probeta. Esta tecnología tuvo éxito en la década de 1950 y se ha desarrollado rápidamente en los últimos 20 años. Se ha vuelto cada vez más madura y se ha convertido en una biotecnología de cría de animales importante y convencional.
La tecnología de fertilización in vitro es de gran importancia para la investigación sobre los mecanismos reproductivos de los animales, la producción ganadera, la medicina y la protección de los animales en peligro de extinción. Por ejemplo, utilizando ratones, ratas o conejos como materiales experimentales, la tecnología de fertilización in vitro se puede utilizar para estudiar los mecanismos de gametogénesis, fertilización y desarrollo embrionario temprano de los mamíferos. En el mejoramiento de las razas ganaderas, la tecnología de fertilización in vitro proporciona un medio barato y eficiente para la producción de embriones, lo que es de gran valor para aprovechar al máximo los excelentes recursos genéticos, acortar el ciclo de reproducción del ganado y acelerar la mejora de las razas. En humanos, la tecnología FIV-ET es una de las medidas importantes para tratar cierta infertilidad y superar las enfermedades ligadas al sexo. La tecnología de fertilización in vitro también es una parte indispensable de la biotecnología moderna, como la transferencia de embriones de mamíferos, la clonación, los transgenes y el control de género.
1. Una breve historia del desarrollo de la tecnología de fertilización in vitro
Ya en 1878, el alemán Scnenk comenzó a explorar la tecnología de fertilización in vitro para mamíferos utilizando conejos y cobayas como animales. materiales Sin embargo, no ha habido éxito. No fue hasta 1951, cuando el chino-estadounidense Zhang Mingjue y el australiano Austin descubrieron simultáneamente el fenómeno de la capacitación del esperma de los mamíferos, que la investigación en este campo logró un gran avance. En 1959, Zhang Mingjue utilizó conejos como material experimental. Recogió esperma (es decir, esperma capacitado en el cuerpo) del útero de una coneja 12 horas después del apareamiento y recogió óvulos de las trompas de Falopio de otras dos conejas superovuladas. y los óvulos completaron el proceso de fertilización en una solución preparada artificialmente fuera del cuerpo. Luego, 36 embriones con escisión normal fueron trasplantados en las trompas de Falopio de 6 receptoras que quedaron embarazadas y dieron a luz a 15 conejas sanas. animales de probeta, su desarrollo normal marcó el establecimiento de la tecnología de fertilización in vitro.
Desde principios de los años 1960 hasta mediados de los 1980, la gente llevó a cabo una gran cantidad de investigaciones básicas utilizando conejos, ratones, ratas, etc. como materiales experimentales. Los espermatozoides se incuban y capacitan inicialmente en el tracto reproductivo de la misma o heterogénea mujer, luego se cultivan y capacitan in vitro usando líquido uterino, líquido folicular, extracto o suero endometrial, y finalmente se cultivan y capacitan con una solución con una composición química clara. Al mismo tiempo, a través de estudios comparativos sobre los efectos de capacitación de los espermatozoides eyaculados y los espermatozoides epididimarios, las personas descubrieron que el semen eyaculado contiene factores desenergizantes y se dieron cuenta de que la esencia de la capacitación es eliminar los factores desenergizantes de la superficie del esperma. Estos logros teóricos y metodológicos han promovido el desarrollo de la tecnología de fertilización in vitro en ratones (Whit-tingham, 1968), ratas (Toyoda y Chang, 1974), lactantes (Steptoe y Edwards, 1978), bovinos (Brackett et al., 1982), cabras (Hamda, 1985), ovejas (Hanada, 1985) y cerdos (Chang et al., 1986) nacieron uno tras otro.
Después de mediados de la década de 1980, la tecnología de FIV con animales domésticos, representada por el ganado, se desarrolló rápidamente. En 1986, Parrish et al utilizaron medios que contenían heparina para tratar el semen congelado del ganado y luego lo fertilizaron con in. Ovocitos maduros in vitro. Tener éxito. Esto es de gran importancia para la investigación y aplicación de la FIV bovina, porque este método puede utilizar ovarios desechados y semen congelado de mataderos para producir embriones in vitro, lo que no sólo es de bajo costo, sino que también tiene efectos estables. Desde entonces, los sistemas de maduración in vitro y cultivo de embriones de ovocitos bovinos han madurado gradualmente y la eficiencia de la producción de embriones in vitro ha mejorado considerablemente.
Actualmente, utilizando la tecnología FIV-ET, se pueden obtener alrededor de tres terneros de cada par de ovarios de vaca desechados. Para aprovechar al máximo los recursos genéticos de las vacas bien criadas, la tecnología de recuperación de óvulos de ganado vivo (Ovum pick UP.OPU) se desarrolló rápidamente a finales de los años 1980. La combinación de recuperación de óvulos vivos y FIV-ET se ha convertido en una importante tecnología de reproducción elegida por los agricultores de países ganaderos desarrollados como Europa, Estados Unidos y Oceanía para ampliar el rebaño de vacas bien criadas.
La tecnología de fertilización in vitro de ganado vacuno no sólo se utiliza en la producción ganadera, sino que también se ha convertido en un importante método auxiliar para el estudio de otras biotecnologías embrionarias, como la clonación, los transgénicos, el aislamiento de células madre embrionarias y el cultivo. y control de género.
2. Procedimientos operativos básicos de la tecnología de fertilización in vitro
Los procedimientos operativos básicos de la fertilización in vitro de mamíferos incluyen los siguientes aspectos:
(1) Recolección de ovocitos y cultura de maduración
1. Recogida de ovocitos: suele haber tres métodos de recogida de ovocitos.
(1) Superovulación: después de que las hembras sean tratadas con hormona estimulante del folículo y hormona luteinizante, los óvulos maduros extraídos de las trompas de Falopio se pueden fertilizar directamente con espermatozoides capacitados. En ganado grande, rara vez se utiliza debido a los complejos procedimientos operativos y al alto costo. La clave de este método es captar el momento en que el óvulo ingresa a la trompa de Falopio y el momento en que el óvulo mantiene la capacidad de fertilización en la trompa de Falopio. Generalmente, es necesario lavar el óvulo antes de que tenga una fuerte energía de fertilización.
(2) Recolección de ovocitos de ovarios vivos: este método utiliza un detector ultrasónico, endoscopio o laparoscopio para aspirar directamente ovocitos de los ovarios de animales vivos.
Entre los animales domésticos, el ganado grande, como el ganado vacuno y los caballos, suele utilizar detectores ultrasónicos para ayudar en la extracción de óvulos. El método consiste en agarrar los ovarios del recto con las manos e insertar una aguja de aspiración de óvulos a través de la pared vaginal. y utilice la guía de imágenes de ultrasonido en modo B para aspirar ovocitos de folículos grandes. Según el nivel actual de tecnología, una vaca sana puede obtener de 5 a 10 huevos por semana. En el ganado, los ovocitos extraídos de cuerpos vivos generalmente necesitan madurar y cultivarse antes de que puedan ser fertilizados con esperma. Este método es de gran importancia para la cría de excelentes hembras y se ha utilizado para la producción comercial en algunos países.
(3) Recoger ovocitos de los ovarios de hembras sacrificadas: este método consiste en extraer los ovarios de las hembras recién sacrificadas, lavarlos, mantenerlos calientes (30 ℃ ~ 37 ℃) y rápidamente transpórtelos al experimento. En la cámara, en condiciones estériles, use una jeringa o una bomba de vacío para aspirar ovocitos de folículos con un cierto diámetro en la superficie del ovario (el diámetro de los folículos bovinos debe ser de 3 a 10 mm. Los ovarios pueden). También se cortarán y se recogerán los ovocitos. La mayoría de los ovocitos obtenidos mediante este método se encuentran en la etapa de vesícula germinal (etapa GV) y deben cultivarse y madurarse in vitro antes de que puedan ser fertilizados con esperma. La clave para recolectar ovocitos de ovarios desechados es prestar atención al aislamiento de los ovarios y prevenir la contaminación bacteriana. Por lo tanto, después de retirar los ovarios de la canal, deben colocarse en un termo que contenga solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), los ovarios deben lavarse varias veces con solución salina fisiológica o PBS antes de agregar antibióticos a la aspiración; todas las soluciones utilizadas.
La mayor ventaja de este método son las abundantes fuentes de materiales y el bajo coste, pero es difícil determinar el pedigrí de la hembra.
2． Selección de células madre: la mayoría de los ovocitos recolectados forman un complejo de cúmulos de ovocitos (complejo de cúmulos de ovocitosx COC) con las células del cúmulo. Independientemente del método utilizado, los AOC recolectados requieren ovocitos con morfología regular, citoplasma uniforme y densas capas circundantes de células del cúmulo. En las investigaciones sobre la fertilización in vitro del ganado, los ovocitos inmaduros suelen dividirse en cuatro grados: A, B, C y D. Los ovocitos de grado A deben estar rodeados estrechamente por más de tres capas de células del cúmulo y el citoplasma es uniforme; el grado B debe tener un citoplasma uniforme y menos de tres capas de células del cúmulo o rodear parcialmente al ovocito de grado C; por células del cúmulo. Los ovocitos desnudos de grado D son ovocitos muertos o degenerados. En la práctica de la fertilización in vitro, generalmente sólo se cultivan ovocitos de grado A y B.
3. Cultivo de maduración de ovocitos: los ovocitos extraídos de la superovulación han madurado en el cuerpo y pueden fertilizarse directamente con esperma sin cultivo. Los ovocitos inmaduros deben cultivarse y madurarse in vitro. Durante el cultivo, los ovocitos recolectados primero se seleccionan y se lavan bajo un microscopio físico y luego se colocan en un medio de cultivo maduro para su cultivo.
El medio de cultivo de maduración de ovocitos de ganado utiliza actualmente TCM199 para agregar suero de ternera preñada, gonadotropinas, estrógeno y antibióticos. Generalmente se utiliza el método de cultivo en microgotas. El volumen de la microgota es de 50 a 200 microlitros y el número de ovocitos colocados en cada gota se calcula como una unidad de 5 microlitros. Una vez que los ovocitos se introducen en las gotitas, se colocan en una incubadora de dióxido de carbono para su cultivo. Las condiciones de cultivo son 39 °C, 100 % de humedad y 5 % de aire con dióxido de carbono. El tiempo de cultivo del ganado es de 20 a 24 horas. Una vez que el complejo del cúmulo de ovocitos madura y se cultiva, la capa de células del cúmulo se extiende cerca del ovocito y las células del cúmulo se disponen radialmente y aparecen teñidas. con tintes específicos del ADN Finalmente, se observó la fase nuclear al microscopio y se encontró que el ovocito se encontraba en la mitad de la segunda división madura.
(2) Fertilización in vitro
1. Tratamiento de capacitación espermática: Hay dos formas de capacitar espermatozoides de mamíferos: cultivo e inducción química. Los fármacos químicos se utilizan comúnmente para inducir la capacitación en esperma de ganado vacuno y ovino, y la heparina y los ionóforos de calcio se usan comúnmente para inducir la capacitación.
2． Fertilización: es decir, el cultivo combinado de espermatozoides capacitados y óvulos maduros, excepto la capacitación inducida por ionóforos de calcio, los espermatozoides y los óvulos generalmente completan el proceso de fertilización en la solución de capacitación. El tiempo de cultivo de fertilización está relacionado con el método de capacitación. En líquido B2, suele durar de 6 a 8 horas, mientras que cuando se utiliza líquido TALP o S.F como esperma, se puede cultivar durante 18 a 24 horas. Los espermatozoides y los óvulos a menudo se cultivan en pequeñas gotas. La densidad de los espermatozoides durante la fertilización es de 1 a 9 × 106/ml. Se colocan 1 a 2 óvulos por cada 10 microlitros de semen. .
(3) Cultivo de embriones
Después de que el esperma y el óvulo son fertilizados, el óvulo fertilizado debe trasladarse al medio de cultivo de desarrollo y continuar cultivándose para verificar el estado de fertilización y el potencial de desarrollo del óvulo fertilizado. Mejor calidad Los embriones pueden transferirse al tracto reproductivo de la madre receptora para continuar su desarrollo o criopreservarse.
El factor clave para mejorar la tasa de desarrollo de los óvulos fecundados es elegir el sistema de cultivo ideal. En ganadería, los medios de cultivo de embriones se dividen en dos categorías: medios de cultivo complejos y químicamente definidos. Hay muchos ingredientes en el medio de cultivo complejo, además de sales inorgánicas y orgánicas, también se añaden nutrientes y suero como vitaminas, aminoácidos, nucleótidos y purinas. Los más utilizados son TCM199, B2 y F10. Cuando se utilizan para cultivar embriones, se puede utilizar un sistema de cultivo de células somáticas, en el que las células somáticas y los embriones se cultivan simultáneamente en microgotitas. Los factores beneficiosos secretados por las células somáticas durante su crecimiento se utilizan para promover el desarrollo embrionario y superar los bloqueos del desarrollo.
El método de microgota se utiliza ampliamente en el cultivo de óvulos fertilizados. La proporción de embriones y medio de cultivo es de 3 a 10 microlitros de medio de cultivo por embrión. Generalmente, se cultivan de 5 a 10 embriones en un embrión pequeño. drop.Utilizar los factores activos secretados por el embrión durante su crecimiento para promover el desarrollo mutuo. Las condiciones de cultivo de embriones fueron las mismas que para la maduración de ovocitos. Algunos laboratorios utilizan cultivos de gases mixtos de 88 N2, 7 O2 y 5 dióxido de carbono para reducir la concentración de radicales libres de oxígeno en la solución de cultivo y mejorar la tasa de desarrollo del embrión. Durante el proceso de cultivo de embriones, es necesario reemplazar el medio de cultivo cada 48-72 horas y al mismo tiempo se observa el desarrollo de los embriones. Cuando el embrión alcanza una determinada etapa de desarrollo, se puede realizar un trasplante de embrión o una criopreservación. Los óvulos fertilizados de ganado vacuno y ovino generalmente se cultivan hasta obtener una mórula densa o un blastocisto antes del trasplante o la criopreservación.
3. Estado de desarrollo y problemas existentes de la tecnología de fertilización in vitro ganadera.
(1) Estado de desarrollo: después de casi 20 años de desarrollo, la tecnología de fertilización in vitro ganadera ha logrado grandes avances. Entre ellos, el ganado tiene el nivel más alto de FIV. La tasa de escisión de los ovocitos eclosionados (es decir, que entran en cultivo maduro) es del 80-90%. La tasa de desarrollo de blastocistos en el séptimo día después de la fertilización es del 40-50%. La tasa de parto después del trasplante es de 40-50% 80 después de la congelación a temperatura ultrabaja. En promedio, se pueden obtener alrededor de 10 ovocitos de grado A de cada ovario y se pueden obtener de 3 a 4 blastocistos in vitro. fertilización y se pueden producir 1-2 terneros después del trasplante.
(2) Problemas existentes y direcciones de desarrollo
1. Problemas
(1) La tasa de desarrollo del blastocisto es baja y el número de células es pequeño.
El bloqueo del desarrollo es común en los óvulos fecundados in vitro durante el proceso de cultivo, es decir, el embrión deja de desarrollarse y degenera después de alcanzar una determinada etapa. El bloqueo de los embriones bovinos se produce en la etapa de 8 a 16 células, lo que da como resultado que la tasa de desarrollo de blastocistos de los óvulos fertilizados in vitro sea mucho menor que la de los huevos fertilizados in vivo. Además, en comparación con los blastocistos fertilizados in vivo, el número total de células y el número de células en la masa celular interna de los blastocistos fertilizados in vitro se redujeron significativamente.
(2) La tasa de partos es baja y el peso del feto al nacer es alto. Después de que la fertilización in vitro de embriones de ganado, especialmente embriones de FIV de ganado, se transfiere a un receptor, la tasa de parto es entre un 15 y un 20 % menor que la de la fertilización in vivo, pero el peso del feto al nacer es de 3 a 4 kg mayor que ese. descendencia de inseminación artificial, lo que resulta en una alta tasa de distocia en la hembra receptora.
2. Dirección de desarrollo
(1) Estudio en profundidad del mecanismo molecular de la maduración de los ovocitos y el desarrollo embrionario. La razón principal de la baja eficiencia de la fertilización in vitro es que las personas
no lo hacen. comprender los mecanismos moleculares de la ovogénesis y el desarrollo embrionario. El mecanismo no se comprende bien. El requisito previo para mejorar en gran medida la eficiencia de la FIV es comprender el mecanismo regulador molecular del desarrollo temprano de los ovocitos y del embrión, y luego utilizar esta teoría como guía para estudiar el sistema de cultivo ideal para promover la expresión estable y ordenada del genoma del embrión. /p>
(2) Fortalecer la investigación sobre el cultivo de folículos preantrales y utilizar los recursos genéticos de excelentes animales maternos. Actualmente, los ovocitos utilizados por la tecnología de FIV son menos de una milésima parte del número total de ovocitos en el ovario de los animales domésticos. . Para ello, por un lado, es necesario mejorar la tecnología de recuperación de óvulos in vivo y, por otro lado, es necesario estudiar la tecnología de maduración in vitro de folículos preantrales y folículos pequeños. Para garantizar una fuente estable de ovocitos y la preservación de ganado hembra bien criado o de animales en peligro de extinción, también se debe fortalecer la investigación sobre la tecnología de criopreservación de folículos y ovocitos a temperatura ultrabaja.
(3) Fortalecer la integración de la fertilización in vitro y otras biotecnologías. La fertilización in vitro es inseparable de la transgénesis, la clonación, el control de género y el cultivo de células madre embrionarias. La fertilización in vitro puede proporcionar una fuente suficiente de embriones para la introducción de genes extraños; proporcionar un sistema de cultivo para ovocitos maduros y embriones clonados para la tecnología de clonación; utilizar espermatozoides X e Y aislados y óvulos para la fertilización in vitro para controlar el género de los mamíferos. De manera similar, el aislamiento de células madre embrionarias también requiere tecnología de FIV para proporcionar embriones y sistemas de cultivo. El desarrollo integral de estas biotecnologías tendrá un impacto significativo en la vida humana.
IV. Tecnología de fertilización asistida
La tecnología de fertilización asistida (Técnicas de fertilización asistida) es una extensión de la FIV. Utiliza métodos artificiales para completar el proceso de fertilización de los espermatozoides y los óvulos, superando el defecto de que los espermatozoides no pueden atravesar la zona pelúcida y la membrana vitelina en algunos casos. Esta tecnología se originó en la década de 1960 y se desarrolló rápidamente en la década de 1980. En medicina, se ha convertido en una de las principales medidas para tratar la infertilidad masculina; en biología básica, se utiliza para estudiar la fertilización y el desarrollo de los mamíferos. También es de gran importancia para salvar animales en peligro de extinción y aprovechar al máximo los excelentes animales reproductores. Actualmente existen dos métodos de fecundación asistida en mamíferos: modificación zonal e inyección de espermatozoides. Dado que ambos métodos requieren el uso de un micromanipulador, la tecnología de fertilización asistida también se denomina microinseminación.
(1) Método de modificación de la zona pelúcida: utiliza métodos físicos o químicos para perforar, eliminar parcialmente o rasgar la zona pelúcida del ovocito para abrir un canal para que los espermatozoides entren al espacio perivitelino y luego al óvulo. Se cultiva con una cierta concentración de espermatozoides para completar el proceso de fertilización. Este método es adecuado para espermatozoides que tienen cierta capacidad de movimiento pero tienen una reacción acrosómica incompleta y no pueden atravesar la zona pelúcida. Su ventaja es que causa menos daño al óvulo, pero para los animales que dependen de la reacción de la zona pelúcida para evitar que la polispermia entre al óvulo, puede causar fácilmente la fertilización del poliesperma y afectar el desarrollo continuo del embrión. Hasta ahora, este enfoque sólo ha tenido éxito en ratones.
(2) Método de inyección de esperma: utiliza un micromanipulador para inyectar esperma directamente en el espacio perivitelino o el citoplasma del ovocito. El primero se llama inseminación subzonal SUZI y el segundo se llama inseminación subzonal SUZI. Se llama inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
La inseminación subzonal tiene requisitos estrictos sobre la cantidad de espermatozoides inyectados: los espermatozoides viables que han sufrido una reacción acrosómica deben inyectarse individualmente; los espermatozoides que no han sufrido una reacción acrosómica se pueden inyectar en cantidades mayores. La ventaja de SUZI es que causa poco daño a los ovocitos y se ha utilizado en medicina clínica. Sin embargo, la polispermia es la principal razón que restringe el desarrollo de esta tecnología. La inyección intracitoplasmática de espermatozoides no tiene requisitos especiales en cuanto a la motilidad, morfología y reacción acrosómica de los espermatozoides. Solo se inyecta un espermatozoide para mejorar la tasa de fertilización, los óvulos deben activarse artificialmente después de la inyección. La inyección intracitoplasmática de espermatozoides se ha utilizado en muchos países como método para tratar los trastornos de la fertilización masculina, y el número de casos de fertilización in vitro obtenidos mediante este método ha superado los 3.000.