¿Qué son los organismos de inclusión y cómo evitarlos?

La formación de cuerpos de inclusión es un proceso dinámico extremadamente complejo que involucra a muchas proteínas, que depende de la tasa de plegamiento y de agregación de la proteína, y está relacionado con el grado de síntesis y degradación de la proteína. Los sistemas de expresión fuertes, las altas concentraciones de inductores y las temperaturas de cultivo relativamente altas a menudo dan como resultado la formación de cuerpos de inclusión. Además de los factores externos, la formación de cuerpos de inclusión depende del comportamiento de plegamiento específico de la proteína en lugar de las propiedades generales de la proteína, como el tamaño, la etiqueta de fusión y la hidrofobicidad relativa. Sin embargo, las características estructurales que limitan la velocidad de plegamiento, como la formación de enlaces disulfuro, son a menudo el paso limitante de la velocidad para el plegamiento correcto de proteínas que contienen enlaces disulfuro (no del todo, porque la ruptura de los enlaces disulfuro en algunas proteínas no afecta su función), las proteínas ricas que contienen enlaces disulfuro tienen una estructura más compleja cuando se expresan en niveles altos, la proteína es propensa a formar enlaces disulfuro no coincidentes debido al entorno reductor en el citoplasma de E. coli. /p> p>

Esta es a menudo la razón principal para la formación de cuerpos de inclusión. Las proteínas de membrana tienen regiones hidrofóbicas expuestas y son propensas a agregarse y formar cuerpos de inclusión durante la expresión. El nivel de expresión también puede ser extremadamente bajo debido a la degradación o toxicidad para las células. La glicosilación de proteínas puede afectar el comportamiento de plegamiento y la solubilidad de las proteínas, y también son propensas a la agregación cuando se expresan en sistemas procarióticos.

Métodos comúnmente utilizados para prevenir los cuerpos de inclusión:

Utilizar un promotor débil o de potencia media, cultivar a baja temperatura, inducción limitada, optimizar las condiciones del medio y realizar expresión de fusión.

Expresarse con chaperonas y enzimas plegables, expresarse en diferentes espacios, seleccionar cepas mutantes u otros sistemas de expresión procarióticos.

Aditivos que aumentan el plegamiento de proteínas:

Aditivos

Posible mecanismo de acción

Glicerol

Tiene efectos sobre proteínas Hidratación priorizada

/Aumentar viscosidad Molécula anfifílica de L-arginina/

Agente osmótico glicil betaína

/

El sorbitol tiene una hidratación preferencial efecto sobre las proteínas

Arabinan aumenta la viscosidad

Xylitol aumenta la viscosidad

El etanol ajusta la polaridad

DMSO ajusta la polaridad

Detergentes zwitteriónicos

Protege las superficies no polares Triton X-100 protege las superficies no polares Las tio betaínas (NDSB) protegen las superficies no polares La sacarosa/trehalosa tiene una hidratación preferencial de las proteínas/aumenta la viscosidad N-óxido de trimetilamina (TMAO) ) tiene hidratación preferencial de proteínas/agente osmótico. El trifluoroetanol (TFE) promueve la formación de estructura secundaria. La baja concentración de clorhidrato de guanidina desestabiliza los intermedios parcialmente plegados/aumenta la solubilidad de las proteínas de conformación nativa. La baja concentración de urea desestabiliza los intermediarios parcialmente plegados/aumenta la solubilidad. de proteínas de conformación nativas Estabiliza el estado estructural natural del polietilenglicol para proteger el glóbulo fundido/aumentar la viscosidad. Debe enfatizarse que al cultivar bacterias, agregar 5% de etanol al medio de cultivo puede desempeñar un cierto papel en la prevención de la producción de. cuerpos de inclusión.

Comparar con otro artículo:

Estrategia para reducir la formación de cuerpos de inclusión

1. Bajar la temperatura de crecimiento de las bacterias recombinantes y bajar la temperatura del cultivo para reducir la formación. de cuerpos de inclusión. El método más común, las temperaturas de crecimiento más bajas reducen la tasa de formación de agregados inactivos y las interacciones hidrofóbicas, lo que puede reducir la formación de cuerpos de inclusión.

2. Agregue aditivos de crecimiento que puedan promover la expresión soluble de proteínas recombinantes. Agregar altas concentraciones de polioles, sacarosa o azúcares no metabolizados al cultivar E. coli puede prevenir la reacción de agregación de proteínas secretadas en el periplasma. Agregar estos aditivos dentro del rango de concentración óptimo no afectará el crecimiento celular, la síntesis de proteínas o el transporte. Otros aditivos de crecimiento que promueven la expresión soluble de proteínas recombinantes incluyen etanol (que induce la expresión de proteínas de choque térmico), sulfhidrilo o disulfuro de bajo peso molecular. compuestos (que afectan el estado reducido del periplasma, afectando así la formación de enlaces disulfuro) y NaCl.

3. Suministre medios de cultivo ricos y cree condiciones de cultivo óptimas, como suministro de oxígeno, pH, etc.