¿Qué es la hibridación molecular?

Pregunta 1: ¿Qué es la tecnología de hibridación molecular? Es el último paso en la ingeniería genética para detectar si el gen objetivo se introduce en las células receptoras. El segundo es la hibridación molecular. La tecnología utiliza genes objetivo marcados para guiar, como El principio de observar si aparecen bandas de hibridación en las células en cuestión es el principio del emparejamiento de bases complementarias

Pregunta 2: Varias hibridaciones comunes en los usos de la tecnología de hibridación molecular. Varios métodos para fijar moléculas de ácido nucleico en soportes sólidos. Luego, se utiliza una sonda marcada radiactivamente para hibridar con la molécula inmovilizada y la ubicación de la molécula de ADN o ARN objetivo se muestra después del desarrollo. Según el objeto que se mide, la hibridación molecular se puede dividir básicamente en las siguientes categorías: (1) Hibridación Southern: después de que los fragmentos de ADN se separan mediante electroforesis, se transfieren del gel a un filtro de nitrocelulosa o membrana de nailon y luego se combinan. con la sonda Hibridación. El objeto a analizar es el ADN y la sonda es el ADN o el ARN. (2) Hibridación Northern: después de la electroforesis, el fragmento de ARN se transfiere del gel a un filtro de nitrocelulosa y luego se hibrida con una sonda. El objeto a detectar es ARN y la sonda es ADN o ARN. Dependiendo del método utilizado para la hibridación, también existen la hibridación de puntos, la hibridación de ranuras y la hibridación de colonias in situ. Hay tres soportes sólidos disponibles para la hibridación: filtros de nitrocelulosa, membranas de nailon y papel de filtro Whatman 541. Las membranas de nailon de diferentes marcas requieren tratamientos diferentes durante los procesos de fijación e hibridación del ADN, se deben seguir estrictamente las instrucciones del fabricante. El papel de filtro Whatman 541 tiene una alta resistencia a la humedad y se utilizó por primera vez para detectar colonias bacterianas. Este papel de filtro se utiliza principalmente para examinar algunas bibliotecas de genes. Las condiciones de hibridación del ADN inmovilizado son básicamente las mismas que las establecidas al utilizar filtros de nitrocelulosa. El papel de filtro Whatman 541 tiene algunas ventajas sobre las membranas de nitrocelulosa: es más barato, más duradero durante la hibridación, menos propenso a deformarse y fragmentarse durante el secado, etc. Sin embargo, si el proceso de desnaturalización no es cuidadoso, la intensidad de la señal de hibridación será significativamente más débil que la obtenida cuando se utiliza un filtro de nitrocelulosa. Por lo tanto, las membranas de nitrocelulosa todavía se utilizan como soportes sólidos para la detección bacteriana de rutina y diversas hibridaciones. La hibridación Southern se puede utilizar para detectar si hay secuencias homólogas a la sonda en los fragmentos de ADN cortados por endonucleasas de restricción. Incluye los siguientes pasos: (1) Digerir el ADN, separar cada fragmento mediante electroforesis en gel y luego utilizar la desnaturalización del ADN. situ. (2) Transferir los fragmentos de ADN a un soporte sólido (filtro de nitrocelulosa o membrana de nailon). (3) Prehibride el filtro para cubrir sitios no específicos en el filtro. (4) Hibridar la sonda con el fragmento de ADN homólogo y luego enjuagar para eliminar las sondas unidas de forma no específica. (5) Verifique la ubicación del ADN objetivo mediante imágenes. Que la hibridación Southern pueda detectar señales de hibridación depende de muchos factores, incluida la proporción de ADN objetivo en el ADN total, el tamaño y la actividad específica de la sonda, la cantidad de ADN transferido al filtro y el emparejamiento entre la sonda y el ADN objetivo. Situación etc En condiciones óptimas, la hibridación Southern puede detectar con mucha sensibilidad menos de 0,1 pg de ADN complementario con una sonda de alta actividad específica marcada con 32 P (gt; 109 cpm/μg) después de varios días de exposición autorradiográfica. Si se transfieren 10 μg de ADN genómico a un filtro, se hibridan con una sonda de varios cientos de nucleótidos de longitud y se exponen durante la noche, se puede detectar una secuencia de copia única de 1 kb en el genoma de los mamíferos. Existen tres métodos principales para transferir ADN de un gel a un soporte sólido: (1) Transferencia capilar. Este método fue inventado por Southern, por lo que también se le llama transferencia Southern (o transferencia). La ventaja del método de transferencia capilar es que es sencillo y no requiere el uso de otros instrumentos. La desventaja es que el tiempo de transferencia es largo y la señal de hibridación después de la transferencia es débil. (2) Transferencia electroforética. Una vez desnaturalizado el ADN, se puede transferir electroforéticamente a una membrana de nailon cargada. La ventaja de este método es que no requiere depurinación/hidrólisis y puede transferir directamente fragmentos de ADN más grandes. La desventaja es que la corriente durante la transferencia es grande y la temperatura es difícil de controlar. La transferencia electroforética suele utilizarse sólo cuando la transferencia capilar y la transferencia al vacío son ineficaces. (3) Transferencia al vacío.

Hay una variedad de instrumentos comerciales para la transferencia al vacío que generalmente colocan una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nailon sobre una pantalla porosa encima de la cámara de vacío, luego colocan el gel sobre la membrana del filtro y el tampón se transfiere desde un tanque de almacenamiento debajo. En flujo medio, el ADN del gel se eluye y se deposita en la membrana del filtro. La ventaja de este método es que es rápido y se puede utilizar a partir de un espesor normal (4-5 mm) y una concentración de agarosa normal (gt;

Pregunta 3: ¿Qué es la tecnología de hibridación molecular del ADN? La base del ADN hibridación molecular Sí, las moléculas de ADN con secuencias de bases complementarias pueden formar regiones bicatenarias estables mediante la formación de enlaces de hidrógeno entre pares de bases.

Antes de hibridar las moléculas de ADN, primero se deben hibridar los dos organismos. se extraen de las células y luego las moléculas de ADN de doble hebra se separan en hebras simples calentando o aumentando el pH. Este proceso se llama desnaturalización. Luego, las hebras simples de ADN de los dos organismos se juntan y se hibridan. La cadena de ADN de un organismo se marca previamente con un isótopo. Si hay partes complementarias entre las moléculas de ADN de los dos organismos, se puede formar una región bicatenaria debido a la alta sensibilidad de la detección de isótopos. -También se puede detectar la región hebrada

Pregunta 4: Biología e ingeniería genética ①La diferencia entre la hibridación molecular del ADN y la hibridación molecular ②¿Qué es exactamente la zona de hibridación ③Además de Agrobacterium? La hibridación molecular del ADN es un tipo de hibridación molecular

2. Hay muchos tipos de bandas de hibridación, como las bandas de hibridación formadas por sondas y cadenas simples de ADN sin marcar en la hibridación molecular del ADN

3. El TDNA está en el plásmido Ti y el plásmido está libre fuera del nucleoide