¿Cuál es la concentración general de los cebadores de PCR?

La concentración de los cebadores de PCR es generalmente de 5 a 20 μmol/L.

Cinco elementos de la reacción de PCR: Hay cinco sustancias principales involucradas en la reacción de PCR: cebadores (los cebadores de PCR son fragmentos de ADN y los cebadores para la replicación del ADN en las células son una cadena de ARN), enzimas, dNTP, plantillas. y tampones líquidos (que requieren Mg2).

Hay muchas formas de diseñar cebadores, que están determinados por el propósito de la PCR en el experimento, pero los principios básicos son los mismos. Hay dos fuentes principales de enzimas utilizadas en la PCR: Taq y Pfu, que provienen de dos bacterias termófilas diferentes. Entre ellos, la eficiencia de amplificación de Taq es alta, pero es probable que se produzcan discrepancias. La eficiencia de amplificación de Pfu es débil pero tiene función de corrección de errores. Por lo tanto, se deben tomar diferentes decisiones según las necesidades durante el uso real.

La plantilla, el ADN utilizado para la amplificación, puede ser de cualquier fuente, pero hay dos principios: primero, la pureza debe ser alta y, segundo, la concentración no puede ser demasiado alta para evitar la inhibición.

La composición de la solución tampón es la más compleja, además de agua, generalmente incluye cuatro ingredientes activos: sistema tampón, normalmente cationes monovalentes HEPES o MOPS, normalmente iones potasio, pero en especial; En algunos casos se pueden utilizar iones de amonio; cationes divalentes, concretamente iones de magnesio.

Información ampliada

El principio básico de la tecnología PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia diana. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización, hibridación y extensión:

① Desnaturalización del ADN molde: después de que el ADN molde se calienta a aproximadamente 93 °C durante un cierto período de tiempo, el ADN molde se duplica. -cadenado o amplificado por PCR El ADN bicatenario se disocia y se convierte en una sola hebra para que pueda unirse al cebador y prepararse para la siguiente ronda de reacción.

② Recocido (renaturalización) de. ADN molde y cebador: el ADN molde se desnaturaliza calentándolo. Después de formar una sola hebra, la temperatura desciende a aproximadamente 55 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria de la hebra simple del ADN molde.

③ Cebador; extensión: la combinación plantilla de ADN-cebador se calienta a 72 °C y la ADN polimerasa (bajo la acción de la ADN polimerasa Taq (como la ADN polimerasa Taq), se utiliza dNTP como materia prima de reacción y la secuencia objetivo se utiliza como plantilla. De acuerdo con el principio de emparejamiento complementario de bases y replicación semiconservativa, se sintetiza una nueva cadena de replicación semiconservadora complementaria a la cadena de ADN molde y se repite el ciclo de desnaturalización. Los tres procesos de hibridación y extensión pueden obtener más "semi-conservación". hebras de replicación retenidas".

Y esta nueva cadena puede convertirse en un modelo para el próximo ciclo. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar cada ciclo y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar millones de veces en 2 a 3 horas. ?

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